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PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链反应是一种体外酶促的DNA聚合反应，具有快速（数小时）、灵敏（ng甚至fg级的靶DNA ）的特点。 自发明以来便以惊人的速度发展，并且得到了广泛的应用。;PCR技术的诞生与发展; 第一节 PCR的原理与基本操作 一、PCR的原理： 实际上是一个在模板DNA、引物(primer模板片断两端的已知序列）和4种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促聚合反应，扩增特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。;第4页/共128页;引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）;主要有三步： 1、变性： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成2条单链。;3、延伸： 在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，从引物的3’端开始，按碱基互补的原则，合成与模板链互补的新DNA链。;;;;第11页/共128页;二、基本操作 （一）试剂： ; ;（二）操作方法 1、模板处理; ; 将反应混合物混匀: 小片段DNA混匀可以用漩涡振荡器 大片段用手指弹匀 离心数秒，使液体沉于管底。 ;3、置循环仪中，95－97℃ ， 变性5－10min。马上冰浴冷却，加Taq酶（1u/μl）2－5μl，短暂离心，再按下述循环扩增。;5、扩增完毕，取少量PCR产物5—10μl，电泳紫外灯下观察结果或用其他方法检测。; 注意事项： 1、操作尽量在冰浴上进行 2、几个标本一起做时，应计算出总量，全加到一个eppendorf管中混匀后，再分装，最后再分别加模板。 1)量准。 2）快。 3）污染机会少。 4）各标本之间误差少。 ;3、计算用量时应根据终浓度、终体积，以及贮存液的浓度计算出所需各液的体积。;第二节 PCR反应中的各种组分;PCR反应的质量指标; ;引 物 设 计;引物（primers);引物的重要性;引物设计原则;PCR Primers;PCR Primers;PCR Primers;引物长度 ;碱基分布的均衡性;引物Tm值;引物二级结构;引物3’端;引物5’端; 引物的内部稳定性;引物的保守性与特异性;扩增区域的二级结构;引物与PCR;引物设计软件;如何使用Primer Premier 5.0;引物同源性分析;（一）引物的设计原则;（2）G+C含量：;（3??碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。; （5）引物之间：2个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。;2、引物的3’端：引物的延伸从3’端开始，引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应。 所以3’端不能有任何修饰，不能形成二级结构，一般情况下，不能发生错配，否则影响产量。 比如：本来应该是A-T配对，A-A或A-G,会降低PCR产量。;3、避开产物的二级结构区 某些引物无效的原因是产物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区。有些计算机软件可帮助确定该区域。;（二）合成引物的质量：PCR引物合成后需经纯化以去除合成产物中的不完整序列等杂质。 一般请公司合成，根据纯化方式和引物的量不同 现在公司服务很全面。你可以直接在引物两端加上修饰或标记，比如加上限制性酶切位点。将来产物扩增后可以直接克隆。 ;（三）引物的浓度 测260nm出的光吸收值，然后根据下面公式计算。 合成引物的重量（总微克数）=33μg×总OD值（光吸收值） 合成界认为：1单位OD值的DNA量相当于33μg。 引物μmol数=μg数/(330×bp数) 一般直接标明摩尔数。 ;(四) PCR引物的使用; 二、DNA聚合酶 Taq聚合酶是从（Thermus aquaticus）嗜热菌中提取出的耐热酶。 95℃仍有活性，但长时间的高温对其活性也有影响。 其活性半衰期：92℃2h 95℃,40min 97.5℃,5min 该酶的应用浓度为：1—2.5u/100μl。;PCR扩增反应的精确性;PCR扩增反应的精确性;DNA聚合