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第十章 DNA诱变;定向进化的原理;第一节 随机诱变;一、错误掺入突变;易错PCR采用的方法：;二、盒式诱变;混合寡核苷酸诱变;三、增变菌株的诱变作用;四、化学诱变;这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。代表药剂：5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR） 为胸腺嘧啶（T）的类似物2-氨基嘌呤（AP） 为腺嘌呤（A）的类似物马来酰肼（MH） 为尿嘧啶（U）的异构体;第二节 DNA体外重组;一、DNA洗牌法（DNA shuffling）;二、交错延伸重组 （staggered extension process）;三、随机引发重组 (random priming in vitro recombination，RPR);随机引发合成短DNA片段混合物； 过滤并纯化DNA片段混合物； 做无引物PCR； 用两端引物进行标准PCR，扩增全长的杂交DNA链。;第三节 寡核苷酸介导的定点诱变;70年代初Φx174DNA（ssDNA 5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象，即产生带野生型基因组的噬菌体。;一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程;二、诱变寡核苷酸的设计要求;三、经典DNA定点诱变;1.背景知识 dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由T占据的位置。 ung-：UDG酶缺陷，UDG酶[尿嘧啶-N-糖基化酶]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基 在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常ung+ dut+菌株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。;（二）位点选择诱变 （altered sites in vitro mutagenesis） ;（三）转化子诱变 （transformer site-directed mutagenesis） ;四、PCR介导的定点诱变;（一）大引物PCR诱变;（二）重叠延伸PCR诱变(overlapping extension PCR);（三）重叠延伸剪接技术 （splicing by overlap extension, SOE）;;五、野生型DNA的筛选和排除;第四节 嵌套缺失;一、外切核酸酶Ⅲ的消化;二、BAL 31核酸酶消化;三、DNaseI消化