《第三章__基因工程制药(中)》-公开课件.ppt

（2）信号肽 酿酒酵母的交配因子 (α-mating factor ,α-MF) 的信号肽pre-pro或前导部分pre：可以介导蛋白质沿分泌通路分泌到细胞外,在分泌过程中可以被自身的膜蛋白酶Kex-2 自动切割去除,Kex-2 的切割位点是其C 末端连续两个碱性氨基酸的氨基端。 可使用外源蛋白自身信号肽,如不能利用自身信号肽,可选择酵母α因子的前导序列，该序列可非常有效地引导体积稍小的产物出胞。 两种产物形式：在α因子信号的引导下,通过高尔基体,分泌到胞外的可溶性蛋白或以包涵体形式存在。 真核生物内许多细胞因子、淋巴因子、酶、激素等在翻译后加工过程中,蛋白前体经酶切变为成熟蛋白时的切割位点也是在连续两个碱性氨基酸的C末端,因此用毕赤酵母表达系统可以对真核蛋白进行正确的翻译后酶切加工。 Kex-2：位于细胞膜上，专一性水解α因子前体中羧基端的肽键，位点为连续两个碱性氨基酸残基,如α因子的Glu - Lys – Arg*Glu - Ala - Glu - Ala( * 表示水解位点) 。 STE13： 识别和水解的是α因子的Glu – Ala*Glu - Ala重复序列,从而保证了蛋白加工过程中的信号肽的切除。 解决方法：采用氨基末端间隔序列解决,在α- 因子的前导肽序列和产物之间加1 个间隔序列,这个间隔序列肽可在体外或体内用特异蛋白酶或酵母天冬氨酰蛋白酶切除。 缺点：信号肽加工、切割不完全 酵母表达基因工程产物时,往往是Kex-2蛋白酶除去α-因子的前导肽序列常不够完全,导致分泌蛋白有一个过长的氨基酸末端。 在采用pGAPZα作为表达载体时,由于信号肽加工不完全,可使表达的外源蛋白的分子量大小增加9KDa ,但一般不影响其生物活性。 （3）选择标记 营养缺陷型标记：通常所用的酵母菌是组氨酸脱氢酶缺陷型的(HIS4)菌株 ,如GS115、KM71 ,只有转化了含HIS4 载体的菌株才可以在组氨酸缺陷的选择性培养基上生长 注意：能在选择性培养基中生长的菌株并不一定含有目的基因, HIS4 + 的转化子中约10 %～50 %根本不含有其它表达载体成分,这主要是因为载体上的HIS4 基因与基因组中的his4 位点发生重组导致回复突变所致,利用电转化时该比例更高。 抗性基因：含有细菌卡那霉素耐药基因的载体对抗生素G418 产生抗性。含有Shble 基因表达产物可以对抗生素Zeocin 产生抗性,而且在大肠杆菌与毕赤酵母中均可用作选择标记。 3、菌株 GS115：含有AOX1 和AOX2 基因,在含有甲醇的培养基中生长迅速(Mut + ) ; KM71 ：AOX1基因被酿酒酵母的SARG4 取代,在甲醇中只能使用AOX2 来代谢甲醇,因此生长缓慢(Muts) ; MC10023：AOX1 和AOX2 基因均被取代,因而在甲醇为碳源的培养基中不能生长,其表型为Mut- 蛋白酶基因缺陷的菌株：SMD1163 、SMD1165 、SMD1168。 蛋白酶缺陷型菌株的活力较差, 转化率低且生长缓慢, 所获外源目的蛋白产量较低。因此, 只有在其他降低蛋白酶解方法均不理想时, 才使用蛋白酶缺陷型菌株。 4、转化 转化巴斯德毕赤酵母的常见方法有四种: 原生质体转化法、电转化法、聚乙二醇(PEG) 法和氯化锂(LiCl) 法。 原生质球和电转化法效率较高 (约103 ～ 104 转化子/μgDNA) 。电转化简单, 原生质球方法复杂。 PEG 方法和LiCl 方法很简单, 但这两种方法转化效率较低, 且不易形成多拷贝。 (1) 目的基因的克隆 (2) 重组载体线性化 (3) 转化 (4) 筛选：利用载体和营养缺陷型菌株的互补性或对抗生素的抗性来进行初筛,复筛可用PCR 。 (5) 外源蛋白的表达：组成型启动子, 醇诱导型启动子。 (6) 放大：表达的条件(如通气状况,pH 值,培养基的组成等) ,经优化以后就可以按比例放大,从摇瓶培养转至大规模发酵。 5、巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的步骤 6、外源蛋白的糖基化 （1）N – 糖基化：寡糖链与外源蛋白肽链糖基化识别位点(Asn - X – Ser/Thr) 天冬酰胺上的氮原子(N) 共价结合; （2）O – 糖基化：寡糖链与外源蛋白肽链丝氨酸/苏氨酸上的羟基(OH) 共价结合。 （3）高等真核细胞糖基化寡糖链含N- 乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸; 而低等真核细胞如巴斯德毕赤酵母在其分泌的外源蛋白上所添加的寡糖链只含甘露糖。 （4） 有些天然分泌时不被糖基化的蛋白, 由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化。如人体内合成的胰岛素样生长因子I 为非糖基化蛋白, 而由巴斯德毕赤酵母表达时, 却有15 % 发生了糖基化作用。 （5） 巴斯德毕赤酵母为其外源蛋白添加寡糖链时, 所选择的丝氨酸和苏氨酸有时也与天然宿主细胞