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浅谈原核表达 向俊蓓 原核表达 将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法。 应用广，操作简单、快捷, 需时较短 表达产量高, 适合工业化 原核表达的一般程序 表达前准备 获得目的基因 构建含目的片段的表达载体( 测序验证) 转化表达宿主菌 诱导靶蛋白的表达 表达蛋白的分析 表达前的准备要素 对表达载体的分析 载体的选择 翻译的起始位点 在起始密码子附近的mRNA二级结构 载体元件 是否为诱导表达型载体 启动子的强弱 多克隆位点 限制性内切酶的位置 终止密码子的有无及位置 融合Tag的有无 筛选报告基因的位置 表达蛋白的最终应用考虑 载体一定要保持原来的遗传背景 表达前的准备要素 对目的片段的分析 基因( 或蛋白) 的大小 表达序列的GC含量 高于70% 亲疏水性 获得目的基因 直接分离法、构建基因组文库分离法, 构建cDNA基因文库分离法、聚合酶链式反应扩增法( PCR) 和化学合成法。 原核表达一般都是利用PCR把目的基因克隆扩增出来。 设计引物 表达外源片段中含有什么内切酶位点 在设计酶切位点的5‘ 端要加保护碱基, 使限制性内切酶能有效识别 注意起始密码子和终止密码子的读码框, 不要造成目的片段碱基移码 引物之间的Tm值相差不宜过大, 最好能一样。一般来说, PCR反应的退火温度不超过Tm值上下5℃; 一对引物不宜形成发夹结构、互相配对, 若配对时最好不要是G- C的结合 3 端以G、C结尾为宜; 把上游引物设计成有义链, 下游设计成反义链, 否则没有片段出现。 /blog/static/30286879200751111825755/ 构建重组表达载体 酶切过程 连接过程 目的片段和载体的比例 酶量 20微升5U 温度 时间 转化表达宿主菌 PCR和双酶切法作初步鉴定后进行测序验证, 进一步检测目的基因的插入方向、阅读框架及片段序列是否正确。 不同的表达载体对应有不同的表达菌株。 诱导表达 对照 温度剃度18,28,37 时间剃度18h ,4~6h, IPTG浓度剃度 0.5 培养基的选择 表达蛋白的分析、纯化、检测 SDS蛋白的净电荷影响迁移率 稀有密码子造成表达产物的截短 Western-Blot 可溶性 裂解细胞是否完全 包涵体 表达量太高 变性复性 表达不出来原因分析 查看多克隆位点和插入序列，是否因为酶切连接而意外引入终止子信号。 对测序结果进行测定，保证每个碱基的正确性。 基因中有无不常用的密码子。 策略 改变诱导温度 IPTG浓度 低温，较长时间的诱导表达有助于蛋白稳定，融合表达，低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。 更换培养基 更换载体，表达系统 心得 接种：挑取单克隆，加足量的抗生素，过夜培养的新鲜菌液。 -20保存,复壮 OD值 0.5~0.6 诱导时间安排 相同条件重复2次后就没有必要再重复 。。。。。。 THE END