五章双向凝胶电泳2D-PAGEP演示教学.pptVIP

第五章 双向凝胶电泳(2D);1. 蛋白质组分析的技术路线;蛋白质组分析的首要要求;生物学问题的提出;2. 双向电泳技术的发展及原理;双向凝胶电泳的发展;　　20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。 　　1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。 　　此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质点。;双向凝胶电泳的基本原理;IPG 胶的材料是 Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH 3~10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。;三种双向凝胶等电聚焦系统;非变性2D：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性/SDS-2D：第一向采用非变性IEF，之后在2% SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白-蛋白间的相互作用。 非变性/还原/SDS-2D：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素 + 5%β-ME + 2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。 变性2D：样品先用2%SDS + 5%β-ME + 95℃变性5min, IEF在8M尿素 + 1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS + 5%β-ME平衡，然后进行SDS。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100KD的蛋白质点少于第三种方式。;3. 仪器简介;第二向： ;图像分析软件： ;4. 双向电泳分析中的样品制备;样品的分级处理;样品的溶解;增加样品溶解性的手段;样品中核酸的去除;亚蛋白质组样品的制备;特殊样品的制备;5. 双向凝胶电泳技术流程;IPG胶条的重泡胀;加样;蛋白载样量;IPG胶条的蛋白质大约载样量;IPG IEF 中 pH梯度的选择 ;预分步收集;聚焦时间的优化 ;IEF的基本条件;两维间的平衡 ;二维 SDS;聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测;有机染料和银染;负 染;胶体扩散染料;