第二章 组织培养基本技术.ppt

缺锌症状： 小叶病，叶片变小，两节之间缩短。叶脉间失去绿色或者变白。 植物缺素症 缺氮：首先表现在老叶上均一的缺绿现象； 缺磷：老叶片发蓝稍带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死； 缺钾：先表现在老叶斑驳的缺绿症状叶缘枯黄，卷曲皱缩，茎的节间变短； 缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心； 缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫； 缺锰：新叶脉间失绿； 缺铁：叶片黄，叶脉绿； 缺硼：顶呀和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝； 缺锌：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑； 缺铜：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早脱落； 缺钼：不能形成花器或花早落。 高压灭菌的原理 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意事项 完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时,开始计时，维持压力0.1～0.15MPa 20分钟。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 ? 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 第四节 外植体的选择和灭菌 一、 外植体的选择 二、 外植体的灭菌方法 三、 污染原因和预防措施 二、外植体的灭菌方法 2、污染的预防措施 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。 现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措施: （2）选择合适的时间去田间采取外植体 避免阴雨天去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。 但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不但要除去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。 （2）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料： 首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片； 第2，将材料放入70%酒精中灭菌数秒钟； 第3，在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min； 第4，放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌5—10min； 第5，用无菌水冲洗5次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1M盐酸中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 3）玻璃器皿的灭菌 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。 4）金属器械的灭菌 5）布质制品的灭菌 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，121?C的温度，灭菌20 min～30min。 6）无菌操作室的灭菌 在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min，后用70%的酒精擦手，并用70%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。 工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。 小 结 第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适