51dna的粗提取与鉴定使用.pptxVIP

专题5 DNA和蛋白质技术;课题目标 ;基础知识;3、提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？(原理);2、如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？;3、提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？;2）、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ①蛋白酶只能使蛋白质水解 ②大多数蛋白质不能忍受60—80℃ 的高温而变性，但DNA在80 ℃ 以上才变性。 ③洗涤剂能瓦解细胞膜， 但对DNA没有影响。;3、DNA的鉴定 ①沸水浴下，DNA遇二苯胺被染成蓝色； 二苯胺鉴定DNA的化学原理： DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。 ②紫外灯照射法： 紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)。;实验设计;实验设计;哺乳动物红细胞： 大肠杆菌： 鸡血细胞：;。 ;（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞：蒸馏水 搅拌 ;（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞：蒸馏水 搅拌 2、植物细胞：洗涤剂和食盐 搅拌和研磨 若探究提取效果，可设置对照实验。;3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ ;（三）去除滤液中的杂质 方案一： DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同；;（三）去除滤液中的杂质 方案一： DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同； 方案二： 加入嫩肉粉（含木瓜蛋白酶） 方案三： 60—75℃恒温水浴保温10—15min ;旁栏问题;（四）DNA的析出与鉴定： 95%的冷酒精 静置2—3min，出现白色丝状物 玻璃棒卷起 加入2mol/L氯化钠溶解， 加入4mL二苯胺试剂，摇匀，沸水浴5min，观察颜色变化。 （注意设置空白对照） ;使用冷的乙醇溶液具哪些优点？;P56操作提示;结果分析与评价;结果分析与评价;练习;练习 ;案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取;2、实验原理;4、课前准备鸡血细胞液;②柠檬酸钠作用;讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？;讨论：;②溶解细胞核内的DNA;讨论：加入蒸馏水的目的？;④滤取含DNA的粘稠物;⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液;答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中;取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015 mol／L的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化;讨论：;答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”; 过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层;③两次析出;（2）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？;;案例二? 以菜花为实验材料进行DNA的粗提取;教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一些去污剂，使植物细胞膜破碎，释放DNA。学生可以设置对照实验，比较哪一种方法可以提取到纯度更高的DNA。一般实验室提取高纯度的DNA都采用一种阳离子去污剂──十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破碎，同时将DNA与植物中多糖等杂质分开，再用氯仿—异丙醇混合液（体积比为24∶1）抽提去除杂质蛋白，得到高纯度的DNA。;3.过滤? 在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速，离心2～5 min，取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 4.沉淀? 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95％的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀3～5 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上。;参考资料