细胞工程动物组织和细胞的培养.docxVIP

4节 动物细胞培养 动物细胞培养类型 (一)细胞原代培养 1.取材分离 ·取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织 块剪碎成 1mm3大小，加入 Hanks液（平衡盐水 BSS） ，冲洗数次。 · Adult Embryo Egg 取材分离 Dissection Enzyme Digestion Finely chopped Further dissection if necessary Cell Culture Primary Explants Organ Culture 2.组织消化： ·是用酶法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。 ·将剪碎的组织块放人三角烧瓶中，加人 30～50倍体积的 0.25％浓度胰蛋白酶 ； ·消化： 37℃水浴内消化 30～60分钟。 ·过滤：如果大部分细胞已经分散，终止消化，以不锈钢筛过滤 (100 μm）滤除未被消化的组织块。 ·离心： 8000rpm/min离心 5分钟， 弃上清液 ,沉淀为细胞。 ·漂洗； Hanks液漂洗两次，每次2～3分钟，加人营养液 。 3.细胞计数 ·细胞悬液 制成后，需要计数悬液中细胞的浓度，通常以细胞个数／ ml 表示。检查方法如下： ·1）在干净的离心管中加人数滴细胞悬液，再加人 6.4％台盼蓝 trypan blue）1滴，混匀后静 2～3分钟； ·2）将计数板（如图）平放在显 微镜台上，在盖片边缘加人 l～2 滴染色的细胞悬液，使之完全充 满计数板与盖片间的空间，勿留 气泡，勿使盖片漂浮； ·3）显微镜下记录计数板四角四个大格中的细胞总数，原则是 : 染蓝的细胞不数（死细胞），无色的细胞计数（活细胞），一团细胞按一个细胞计数。 ·计数时要注意 ： ·如果细胞团数超过 10％，说明消化过程进行的不充分； ·如果细胞数少于 20-50个说明稀释的不当 . (二)传代培养 ·当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展连片，占满器皿表面。 ·这时需要对其分离重新培养， 这 一操作过程称之为传代。 ·有80％～ 90%或刚刚全部汇合的细胞，是传代的理想时期。 具体方法如下： 1)吸出培养瓶内旧培养液； 2）加人胰蛋白酶和 EDTA 混合液盖满瓶 底对细胞进行消化； 3）吸出消化液，加人 Hanks液，洗去 残留的消化液。 4）加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度； 5）重新接种培养 Tissue culture flasks ·T-flasks ·Petri dishes (三)微载体培养 microcarrier culture) ·1967年， Van Wezel开发了微载体系统培养 贴壁细胞。微载体是直径为 60-250μm 的微珠。 ·最初使用的材料为二乙基氨基乙基－交联葡聚糖 A －50 ·后经改进，用带不同基团的 葡 聚糖（ dextran）交联成几种大分子， 以利于细胞的贴壁及生长。 ·目前使用的 dextran I、Ⅱ、Ⅲ三种型号都属于 交联葡聚糖为基质的微载体，每种微载体所带基团各不相同。 微载体培养细胞的具体步骤 1）选择合适的微载体类型 ●先用少量三种微载体做细胞培养试验，一定时间内计算 细胞贴壁数量， 比较细胞用量、微载体用量，以此选出适当的微载体。 （2）浸泡水化及消毒 ·在玻璃容器中加人适量的微载体，加入磷酸缓冲液（ PBS）浸泡 3小时以上，轻轻搅动。 ·搅动速度 50～70rpm／min为好。·高压蒸汽灭菌， （3）接种 ·根据细胞类型决定接种浓度，例如，人成纤维细胞的适宜接种浓度为 10 cells／微载体；非洲绿猴肾细胞（ vero）为 5 cells／微载体。 ·接种要达到一定浓度，但过高也不利。 培养中的搅拌转速： ·提供均相培养环境·防止微载体集聚·促进汽液交换 ·30-120r/min （4）培养观察 ·显微镜直接观察微载体上细胞生长 ·将微载体上的细胞消化下来计数并计算其浓度 : ·取1ml均匀的培养细胞样品，待微载 体沉淀后吸去上清液，加 PBS液清洗。 ·加胰蛋白酶 37℃消化 15min，吸出消化液后加到培养液中，过滤分离微载体 ，离心弃上清夜，保留细胞沉淀； ·加美蓝染液 2ml，血球计数器计数，计算细胞浓度。 （5）消化 ·传代培养或收获细胞均需使细胞脱离微载体，通常采用酶消化法。 消化步骤： ·停止搅动，待微载体沉淀后，去净培养液，用含 0.25％EDTA 的PBS（ pH6.7），按 50～ l00ml ／g微载体量清洗微载体，弃 EDTA-PBs 。·加人胰蛋白酶一 EDTA ，37℃搅动消化 15min ·加人含 10%血清的培养液，终止消化作用 。 （6）分离细胞 ·脱离微载体的细胞培养液放人容器， ·离心 沉淀微载体（ 400r／min，2分钟）收集细胞。 ·还可用过滤