重组体的筛选和鉴定.pptxVIP

8 重组体的筛选和鉴定筛选（Screening）遗传表型（phenotype）：是生物体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。本章教学目的和要求： 掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹（Western blotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道基因筛选法。重点： 常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（ELISA）难点： 免疫印迹（Western Blotting）法的原理转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。非转化子：未接纳载体或重组分子的转化细胞。重组子：含有重组DNA分子的转化子。非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。期望重组子：含有目的基因的重组子。非期望重组子：不含有目的基因的重组子。8.1 遗传学检测法一、利用载体提供的表型特征筛选重组体1 抗药性标记及其插入失活选择法原理：pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。pBR322因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。pBR3224363PstI酶切外源DNA黏性末端连接酶重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets) PstI酶切黏性末端导入涂布在含Tc的平板上重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)野生型的E.coli (ampstets) 影印在含Ap的平板上空载体转化子(amprtetr)对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。 pBR322抗菌素标记选择（1）四环素抗性基因 Tetr ：抑制细菌生长，但不杀死细菌。（2）氨苄青霉素抗性基因 Ampr ：产生?-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。选择过程：（1）四环素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。无环丝氨酸培养基氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。2.蓝白斑筛选法+半乳糖葡萄糖乳糖?-半乳糖苷酶 +5-溴-4-氯靛蓝半乳糖Xgal深蓝色原理：载体上有一段?-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的?片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的?-半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的?-半乳糖苷酶。选择过程假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏?肽）。β-半乳糖苷酶显色反应筛选法?-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。蓝白菌落筛选白色菌落3.噬菌斑筛选法噬菌斑(plaque)噬菌斑是指在宿主细菌的菌苔上，噬菌体使菌体裂解而形成的空斑。4.载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因筛选植物转化细胞常用的报告基因报告基因（reporter gene）：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。报道基因（reporter gene)（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖苷酸酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。（4）其它几种报道基因的作用原理紫外光照GFP发绿色荧光GUS荧光产物4-甲-β-D-葡萄糖苷酸5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸GUS蓝色水解产物Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP转入萤火虫的luciferase的烟草GFP 老鼠GFP- Kac的狗GFP Alba發青綠光芒的兔子①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动植物转化子的标记基因。④β-葡萄糖酸酶基因（GU