讲课——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.pptVIP

尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。 只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3 （二）细菌数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板法） （1）统计原则 ①选 30-300 个菌落的平板统计 ②每个稀释度取3个平板取其平均值 （二）样品稀释 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液 原则：确保平板上的菌落数在30-300之间。 （三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2、培养：细 菌：30-37℃，1-2d; 放线菌: 25-28℃, 5-7d; 霉 菌: 25-28℃, 3-4d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象 　　 * 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 细菌脲酶 一、课题背景 分离产生脲酶的细菌 1、实例： PCR技术 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 ㈠.筛选菌株 2.筛选菌株的培养基KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。 （2）统计结果： 每克样品中的菌株数=（C/V)× M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。 缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 2、显微镜直接计数 利用血球计数板(血细胞计数板） 在显微镜下计算一定容积里样品 中微生物的数量。 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 缺点： 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。 设置对照—同等条件下，培养空白培养基 （三）设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 [一]无菌操作 1、取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 [二]做好标记 注明培养基种类、培养日期、 平板培养样品的稀释度等。 [三]规划时间 二、操作提示 三、实验过程 （一）土壤取样? （1）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微物，其中70-90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3-8cm处中分布着绝大多数的细菌。 （2）取样要求：铲去表层土。 菌落计数 配制土壤 溶液 系列稀释 涂布平板与培养 （四）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存 酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 * * *