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引物设计原则;5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
6、引物3′端碱基是引发延伸的起点,因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。
7、引物的5′端可以修饰,如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素,荧光物质,地高辛标记,加入其它短序列包括起始密码子,终止密码子等。在PCR的起始反应中,引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中,这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去,所以如此引物参与的PCR产物,既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。
;;;;;RT引物的茎环序列
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC-3’;上游引物;;RT引物分析
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