DNA芯片技术的原理与应用介绍.ppt

喷墨打印技术 离片合成法(off-chip synthesis)　首先利用各种方法制备出寡核苷酸探针，再由具有多个微细加样孔的阵列复制器(arraying and replicating device,ARD)及由电脑控制的机器将探针按一定的顺序固定在固相载体表面，再由紫外交线交联固定后得到DNA方阵。 该方法优点是芯片制造速度快,成本低,而且芯片之间制造误差小。其缺点是与原位合成法相比,构成方阵的DNA片段需要先合成、纯化，以及在制造DNA芯片前必须将如此大量具有微小差别的片段分别保存,并且需要特制的自动点样装置。 点样法? 即预先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分离得到cDNA，再通过点样机直接将其点到芯片上。寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通过多孔玻璃合成法。肽核苷酸虽然在制备上比较复杂，但是它与DNA探针相比，由于PNA（肽核酸）与DNA结合的复合物更加稳定和特异，因而更加有利于单碱基错配基因的检测。 来自某一细胞的cDNA必须进行预处理，纯化，扩增以及分类，然后再利用机械手把它们准确地固定在基板的相应位置上，为了保证cDNA芯片检测的准确性，在制备cDNA芯片以前必须提高低表达基因cDNA的丰度，降低高表达基因cDNA的丰度。 1.4.2 样品的制备 样品的制备包括：样品的分离纯化，扩增，标记 分离纯化：样品来源于活的细胞，使用一定方法分离并纯化DNA或RNA（特别是mRNA）。只有达到一定纯度的样品，才能保证后续操作的正确。 样品的扩增：扩增的目的在于获得足够的样品量。现已发展出固相PCR系统。 样品的标记：主要采用荧光标记法，也可用生物素，或放射性核标记。标记的方式采用PCR或RT-PCR。常用的荧光色素为Cy3、Cy5。用Cy3、Cy5标记dNTP，经PCR后，产物即可被标记。待测样品和对照可采用双色荧光标记。 1.4.3 分子杂交 芯片的杂交：将已知序列的DNA探针显微固化于支持物表面，将已标记好的样品与之进行杂交，杂交过程一般在30分钟完成。 电子基因芯片：杂交速度更快。 采用肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探针可消除DNA二级结构的影响。 1.4.4 遗传信息检测 原理：待测样品与支持物上探针列阵杂交后，荧光标记的样品结合在芯片的特定位置，未结合的探针被除去；样品与探针严格配对的杂交分子，热力学稳定性高，产生的荧光信号强，不完全配对的，荧光信号弱；不能杂交不产生荧光信号。 分析：采用激光扫描或激光共聚焦显微镜采集杂交信号（位置、强度、颜色），并与对照比较，经相关软件进行图像和数据处理。即可得也待测样品的信息。 经以上获得的数据十分庞大，还需进行分析，比较，归纳，才能得出明晰的结论。 DNA芯片的应用领域 科学研究 临床疾病诊断 环境检测 药物研究开发 法医学鉴定 动植物检疫 食品检测 军事应用 健康管理 运动医学 DNA芯片的应用概况 2.1 基因表达的分析与检测 将不同条件下某生物体中转录出的mRNA标记后与代表它所有基因而制成的DNA芯片杂交,通过分析杂交位点及其信号强弱,就可得出不同条件下各基因的表达情况,还可鉴定出某些未知功能基因,发现新基因,这一应用目前已成为DNA芯片研究中的一个重点和热点。 DNA芯片具有高度的敏感性和特异性，可自动、快速地同时检测成千上万个基因的表达，基因表达的分析研究有利于揭示不同层次上多基因协同作用的生命过程。 应用cDNA表达谱芯片对大鼠心脏生长发育及损伤过程中基因表达的改变进行了研究。心脏从胚胎到成年的发育过程中基因表达发生了明显的变化，在1075点芯片上，以成年心脏作为对照，胚胎期的差异表达基因多于初生期的差异表达基因，而在胚胎期中的第13天差异表达最明显，然而当出现心肌肥厚和心力衰竭时，有些在心脏发育期才表达的基因重新被表达，这说明压力负荷诱发的基因表现型与心脏生长发育的基因表现型有某种关联。 2.2 基因突变及多态性的检测 将DNA芯片技术用于检测分子突变，能准确地确定突变位点和突变类型，检测多个基因乃至整个基因组的突变。Hacia等采用含有96000个寡核苷酸探针芯片研究遗传性乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1外显子11位点可能发生的突变，结果在15例患者样品中检测到14例患者存在不同的突变（包括点突变、插入、缺失等突变），而在20个对照样品中均没出现假阳性，同时还检测出了8个单核苷酸多态（SNP）。在多态性研究方面，Kozal等应用基因芯片研究未曾接触蛋白质酶抑制剂的HIV患者中HIV—lclade蛋白质酶多态，总共分析了114例样本，发现蛋白质酶基因存在很大程