小鼠部分组织的石蜡切片制作.docVIP

小鼠部分组织的石蜡切片制作 一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其组织结构。 二、材料与用具 1．材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 三、实验内容与步骤 1．取材及固定 取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组织块。用先用0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1，固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗 固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。 3．脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ) 组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12 hr，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3 hr左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15～30 min左右。在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50:1。 简化步骤如下： 70%（一夜）——80%（1 hr）——90%（30分）——95%（30分）——100%（15分）—— 酒精+ 二甲苯（15分）——二甲苯（3分）—— 石蜡+ 二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4．透明 透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经过透明剂处理的组织块用肉眼对光观察呈透明现象，所以这个过程称为透明。 常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等，这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂，因此透明的时间宜短，一般在20 min即可。 透明时组织块由无水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中1 hr左右，然后取出放入纯二甲苯中20 min即可。 5．浸渗 浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中，然后再通过各种方法使这种物质凝固，而将组织材料包埋其中。 石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程。石蜡切片法是将加热的石蜡渗到组织中而火棉胶切片法是使火棉胶渗到组织间隙中去。 在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中，使其杂质沉淀。石蜡最好选用软蜡和硬蜡两种，软蜡熔点为45～50℃之间，硬蜡熔点为56～58℃之间，60～62℃的硬蜡很少用。冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温较高时多用硬蜡。浸渗应在自动恒温箱中进行。 组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下： 软蜡1????????? ? 30min 软蜡2????????? ? 30min 硬蜡1????????? ? 30～60min 硬蜡2????????? ? 60～120min 这一时间不是固定不变的，应视组织块的种类及大小而相应延长或缩短浸蜡时间。浸蜡的总时间一般为：0.5立方厘米的组织块时间为6～8 hr；0.2～0.3立方厘米的组织块时间为3～5 hr；0.1～0.2立方厘米的组织块时间为2～3 hr。当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉淀或过滤后再使用。浸蜡不透包埋后会出现白色不透明部分，此时需要在浸蜡一次。 6．包埋 包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中，石蜡包埋法如下。 浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡