组织石蜡包埋切片HE染色的基本流程.docVIP

组织石蜡包埋切片HE染色的基本流程 一 取材和固定 取材后经固定24小时（4%PA灌注取材的后固定6~8小时）以后，流水冲洗24小时，置于70%~80%乙醇中，可长期保存。 二 脱水和包埋 1、95%ALC（二道） Ⅰ 2~4h Ⅱ 2h 2、无水ALC（二道） Ⅰ 1.5h Ⅱ 1h 3、二甲苯+无水乙醇（1：1） 20min 4、二甲苯（二道） Ⅰ 10min （注：脱水透明esp.透明时间可适当延长） Ⅱ 10min 5、浸软蜡（50~52℃）（二道） Ⅰ 30min Ⅱ 1h 6、浸硬蜡（58~60℃）（二道） Ⅰ 30min Ⅱ 30min 7、包埋：注意温度、切面。 三 切片 修、切、展、贴、烤（烤片55~60℃） 3~10h 四 HE染色 1、二甲苯脱蜡 五道，每道5~10分钟 2、无水乙醇 Ⅰ 5min Ⅱ 5min 3、95%乙醇 Ⅰ 5min Ⅱ 5mn 4、80%乙醇 5min 5、70%乙醇 5min 6、D．W． 3~5min 7、Harris苏木素液 5min（冬天可适当延长，eg.20min） 8、水洗 9、0.5%盐酸酒精分色 3~10seconds，镜下观察 10、水洗蓝化 15~30min（注意换水） 11、70%乙醇 5min 12、80%乙醇 5min 13、伊红液（95%乙醇溶液） 3~30seconds 14、95%乙醇 Ⅰ 1min Ⅱ 5min 15、无水乙醇 Ⅰ 5min Ⅱ 5min 16、二甲苯+乙醇（1：1） 5min 17、二甲苯 Ⅰ 5min Ⅱ 5min Ⅲ 5min 18、中性树胶封片。 HE染色注意事项： 染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。 切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。 切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。 在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。 切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。 最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。 苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。