动物分子生物学第3章(1) DNA复制.ppt

4.致癌的RNA病毒：白血病病毒、肉瘤病毒、HIV（含逆转录酶） 以病毒的正链RNA为模板，在逆转录酶的作用下形成负链DNA； RNaseH水解杂合分子中的RNA分子，得到单链的负链DNA； 以负链DNA为模板合成互补的正链DNA，得到双链的病毒DNA； 在病毒整合酶的作用下，双链DNA 整合到宿主基因组内，成为前病毒。前病毒可随宿主DNA一起进行复制、转录和翻译，形成新的病毒颗粒。 本节重点内容 θ复制、σ复制、 D环式复制特点 DNA的半不连续复制相关事件 DNA复制的酶：聚合酶、连接酶、引物酶、 解链酶 DNA复制的起始：复制子、复制体、引发体 DNA复制的终止：真核生物DNA末端防止缩短的方式 脉冲标记实验： 以E.coli为材料，在培养时，培养基中加入同位素[3H]标记的dTTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长1000~2000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大20~50倍。 脉冲追踪实验： 目的是检测早期合成的DNA片段以后的命运又是如何的？是依然如旧的短片段，还是连接成了长片段。这个实验是先进行标记培养30秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数为70S~120S较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Attachment of bacterial DNA to the membrane could provide a mechanism for segregation Septum-----隔膜 （一）DNA聚合酶 1957年 Arthur Kornberg首次发现了DNA聚合酶I、II和III。 DNA聚合酶：以DNA为复制模板，将DNA由5’端点开始复制到3’端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成。 共同特点是： ⑴需要提供合成模板；⑵不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3’－OH；⑶合成的方向都是5’→3’；⑷除聚合DNA外还有其它功能。 DNA聚合酶的功能 DNA聚合酶I： 主要用于DNA的修复和RNA引物的替换 DNA聚合酶II： 不是复制的主要聚合酶，可能参与DNA的损伤修复 DNA聚合酶III： DNA链的延长 全酶的 非对称二聚体 由多种亚基组成 核心酶：含有α，ε和θ三个亚基 β二聚体：滑动钳 γ复合物：由γ（δδ’χψ）2组成，是装载滑动钳的载体 τ二聚体：有助于核心酶的二聚化 原核生物的DNA聚合酶III的组成： 原核生物的DNA聚合酶III的活性： 5→3的聚合酶活性： 3→5外切酶活性： 最适底物是单链是DNA，只产生5‘-单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从3’端开始切除一个核苷酸。 5→3外切酶活性： 要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。 DNA聚合酶α：主要的酶（占总量的80-90%），分子量为300KD，含有4个或5个亚基，主要负责染色体DNA的复制。 DNA聚合酶β：分子量为45KD，仅含有一条链，主要作用是修复核内DNA。 DNA聚合酶γ：分子量为140KD，存在于线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。 DNA聚合酶δ：与上述真核生物的DNA聚合酶不同，而与原核生物的聚合酶类似，具有3→5核酸外切酶活性。 真核生物的DNA聚合酶 （二）DNA连接酶 (DNA ligase) 冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ除去RNA引物，填补空缺， DNA连接酶将DNA缺口上相邻的3’-OH和 5’-P连接成磷酸二酯键。 DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键，但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。 所需条件： 1）切刻的3’-OH和5’-P相邻； 2）切刻各自碱基处于配对状态； 3）需要能量； DNA聚合酶只能使DNA从引物的3’端延伸，没有起始合成DNA链的能力，那么DNA复制如何起始？ RNA可提供DNA复制的3’端 （三）引物酶 (primase) 机理：引物酶依据模板的碱基序列，从5’→3’方向催化NTP的聚合，生成的短链的RNA引物。引物留有3’-OH