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酶标抗体最佳工作浓度的确定 临床免疫学检验教研室 实验目的 掌握ELISA试验酶标抗体最佳工作浓度的确定方法。 实验原理 在ELISA试验中,反应试剂工作浓度对结果影响较大,因此必须进行最佳工作浓度的选择。本实验用人IgG包被酶标板后,加入不同稀释度的酶标抗人IgG进行ELISA试验,从而确定酶标抗体的最佳工作浓度。 1、酶标板 2、人IgG 3、pH9.6的碳酸盐缓冲液 4、1%BSA 5、HRP-兔抗人IgG 6、ELISA浓缩洗涤液 7、ELISA底物液(分A、B二瓶) 8、ELISA终止液 试剂与器材 实验操作 1、用pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原(人IgG)稀释至1μg/ml,加入酶标板中,每孔100μl,4℃包被过夜; 2、用蒸馏水按1:25稀释浓缩洗涤液; 3、用洗涤液洗涤3次,甩去孔内液体,拍干; 4、每孔中加入1%BSA(用洗涤液配制)200μ1进行封闭,37℃孵育30 min,用洗涤液洗涤3次,拍干; 5、各孔加入用洗涤液稀释的不同稀释度HRP-兔抗人IgG((空白、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280)100μl,37℃孵育30min,洗涤5次,拍干; 6、显色:每孔先加显色剂A 50μ1,再加显色剂B 50μ1,混匀后置37℃孵育10分钟; 7、加终止液终止反应,测定OD450nm,取OD值为1.0左右的浓度为酶标抗人IgG工作浓度。 注意事项 1、洗涤时各孔需加满洗涤液,每次浸泡或振荡1min后弃去拍干,防止不能洗净。 2、加样时不可太快,避免加在上部和产生气泡。不可重复加和漏加,或加在两孔之间。 3、蛋白质包被条件的选择:包被PH、温度、时间及蛋白量对包被效果均有影响。一般多采用pH9.6的碳酸盐缓冲液4℃包被18~24h,蛋白质包被的最适浓度需预实验滴定,对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。 思考题 在ELISA检测方法中,包被、封闭、洗涤分别代表什么实验过程,其主要作用是什么?
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