临床免疫学—酶标抗体最佳工作浓度的确定.pptVIP

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2020-03-09 发布于江西
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临床免疫学—酶标抗体最佳工作浓度的确定.ppt

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酶标抗体最佳工作浓度的确定临床免疫学检验教研室实验目的掌握ELISA试验酶标抗体最佳工作浓度的确定方法。实验原理在ELISA试验中，反应试剂工作浓度对结果影响较大，因此必须进行最佳工作浓度的选择。本实验用人IgG包被酶标板后，加入不同稀释度的酶标抗人IgG进行ELISA试验，从而确定酶标抗体的最佳工作浓度。 1、酶标板 2、人IgG 3、pH9.6的碳酸盐缓冲液 4、1％BSA 5、HRP-兔抗人IgG 6、ELISA浓缩洗涤液 7、ELISA底物液(分A、B二瓶) 8、ELISA终止液试剂与器材实验操作 1、用pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原（人IgG）稀释至1μg/ml，加入酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜； 2、用蒸馏水按1:25稀释浓缩洗涤液; 3、用洗涤液洗涤3次，甩去孔内液体，拍干； 4、每孔中加入1％BSA（用洗涤液配制）200μ1进行封闭，37℃孵育30 min，用洗涤液洗涤3次，拍干； 5、各孔加入用洗涤液稀释的不同稀释度HRP-兔抗人IgG（（空白、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1：1280）100μl，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干； 6、显色：每孔先加显色剂A 50μ1，再加显色剂B 50μ1，混匀后置37℃孵育10分钟; 7、加终止液终止反应，测定OD450nm,取OD值为1.0左右的浓度为酶标抗人IgG工作浓度。注意事项 1、洗涤时各孔需加满洗涤液，每次浸泡或振荡1min后弃去拍干，防止不能洗净。 2、加样时不可太快，避免加在上部和产生气泡。不可重复加和漏加，或加在两孔之间。 3、蛋白质包被条件的选择：包被PH、温度、时间及蛋白量对包被效果均有影响。一般多采用pH9.6的碳酸盐缓冲液4℃包被18～24h,蛋白质包被的最适浓度需预实验滴定，对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。思考题在ELISA检测方法中，包被、封闭、洗涤分别代表什么实验过程，其主要作用是什么？