酵母培养实验.docVIP

酵母培养与酒精发酵实验 一、实验目的 掌握酵母培养与酒精发酵的基本原理和操作方法，了解影响酵母培养与酒精补料分批发酵的主要因素。 二、实验原理 本实验综合运用生物工艺学课程中所学的基本原理和发酵方法，对淀粉质原料酒精发酵过程进行全程监测，模拟工业生产上的整个过程，因此是一个综合性很强的实验。要求学生较灵活地运用基本知识，解决实验过程中出现的问题，并在实验后系统总结获得全面提高。 麦芽中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，通常包括蒸煮（液化）、糖化等处理。蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，目前多数厂家开始利用α-淀粉酶的液化作用来替代蒸煮过程，这样可大大减少能源消耗。液化后的醪液能更好地接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。　　α-淀粉酶，又称为1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，广泛存在于动、植物和微生物体中，如麦芽或动物的唾液、脾脏中均含有较多的α-淀粉酶，而当今α-淀粉酶的工业化生产也主要是利用微生物工程菌进行生产的。α-淀粉酶容易溶解于水和较稀的缓冲液中，它能够切断淀粉分子中的α-1，4糖苷键，生成糊精及少量麦芽糖或葡萄糖，从而使淀粉遇碘变蓝的特异性颜色反应逐渐消失，由此颜色反应消失的速度即可测出该酶的活性。 工艺流程如下：麦芽→加水拌料→液化→糖化→发酵→蒸馏→酒精 ↑ 一级种子 ↑ 耐高温酒精活性干酵母→活化 发酵醪中酒精含量的测定方法很多，如常规蒸馏法、碘量滴定法、比色法及改良康维法等，本实验采用第一种方法。 三、器材与材料 1、酵母菌种，使用前必须活化。 2、12oBx麦芽汁培养基 3、麦芽汁（见麦芽汁处理），生化培养箱，摇床，离心机，分光光度计，糖份、酒精测定试剂及装置。 四、实验步骤及方法 1、培养基准备 麦芽汁培养基：将干麦芽粉，以200g麦芽加700ml去离子水，加入1g中温α-淀粉酶，在65℃水浴锅中处理3-4h，糖化程度可用碘滴定。将糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒入糖化液中搅拌煮沸后再过滤。将滤液调节至pH约6.4。每组分装后于121℃ 2、酵母活化 3%酵母粉（7.5g），2%葡萄糖（5g），溶解于250ml去离子水中。在35℃复水20min，降温至32 3、一级种子培养 250mL三角瓶，12oBx麦芽汁培养基，装液量50mL；接活化液约4mL，30℃，150rpm/min摇瓶培养6-8h。细胞浓度达1.5×108 采用血球计数法进行细菌形态观察和活菌计数，并记录实验结果。在无菌操作台取培养液0.5ml，加入2滴0.05%美蓝染色液，置于装有4.5ml无菌生理盐水的试管中摇匀。无菌操作用移液管滴取菌液于血球计数板中央，放置3分钟后用显微镜观察计数，并且计算出芽率。详见《微生物学实验P54》。 4、乙醇发酵 ①接种：按8%接种量将一级种子分别接入至2只装有100ml麦芽汁培养基的三角瓶中静止培养。其中，一瓶用于测定发酵参数，一瓶始终置于培养箱中培养。 ②补糖：发酵前期，接种4h后补加5%葡萄糖0.2ml，以后每2h补加5%葡萄糖0.2ml至对数生长期后期（具体时间根据菌体生长而定）。 发酵中后期，每4h可加入5%左右的葡萄糖2ml。 ③温度：发酵前期30℃，发酵中后期 ④细胞浓度：发酵前期，接种2小时后每小时测定一次细胞浓度至稳定期后，再间隔2小时测一次细胞浓度。用血球记数板法测量菌体量及出芽率，并绘制生长曲线。 ⑤湿菌体量的计算：发酵结束，离心后，用无菌水洗涤2次，称量湿菌体重。 5、蒸馏,测酒精度 五、实验数据处理 (1)根据实验过程的检测和记录数据，绘制生长曲线。 (2)湿菌体重 (3)酒精度 实验分组及详细安排 以3-4人为一组。周一和周二模块3同学分为7组进行培养基和一级种子制备等基础工作，模块1同学进行遗传学实验。周三以后全体同学共同进行酒精发酵实验，共分为18组，其中模块1分为11组，模块3分为7组。在周一和周二模块3同学也需要配制模块1同学实验所需培养基、试剂、一级种子液等。以下列出每天每组的各实验器材及药品准备量。 周一上午：分发实验资料，老师讲解。 （1）配制麦芽汁培养基（1个250ml三角瓶装液量为50 ml，其余数个（模块3第1-5组6个，6组和7组4个）250ml三角瓶装液量为100 ml，灭菌待用）。 （2）同时，每组准备好