分光光度法测定叶绿素含量.docxVIP

1、实验目的 1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。 二、实验原理 叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植 物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件 下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和 甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素 a 和 b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。 叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有： 原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。 分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗 伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。 叶绿素 a 和叶绿素 b 在 645nm 和 663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于 652nm 处。 因此测定 提取液在 645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素 a、叶绿素 b 和总叶绿素的含量。 三、仪器、原料和试剂 仪器 分光光度计、电子顶载天平(感量 0．01g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水 纸、擦境纸、滴管。 原料 新鲜(或烘干)的植物叶片 试剂 1. 96％乙醇(或 80％丙酮) 2. 石英砂 3. 碳酸钙粉 四、操作步骤 取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪 碎的新鲜样品 2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及 3mL95％乙醇，研成均浆，再 加乙醇 10mL，继续研磨至组织变白。静置 3～5min。 取滤纸 1 张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至 100mL 棕色 容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为 止。最后用乙醇定容至 100mL，摇匀。 取叶绿体色素提取液在波长 665nm、645nm 和 652nm 下测定吸光度，以 95％乙醇为空白 对照。 五、计算 按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素 a、b 和总叶绿素的含量 叶绿素 a= （12.7 A  665 -2.69 A  645 ）× V 1000 ?W 叶绿素 b=（12.7 A  645 - 2.69A  665 ）× V 1000 ?W 总叶绿素 a=（20.0A  645 + 8.02 A  665 ）× V 1000 ?W ? ? 或总叶绿素 a= A652 V 34.5 1000 ?W 几种叶绿素含量测定方法比较 叶绿素含量是植物生长过程中一个重要的生理指标,由于其对周围环境很敏感,并与植物的 光合作用、营养吸收等密切相关,被广泛作为植物生长的常规测定指标项目。叶绿素含量的 测定方法有多种,在国际上以传统的 Arnon 法(也称研磨法)应用最为广泛。但该法需要把植 物材料研磨并经转移、过滤或离心处理,不仅工作量大,而且不可避免地使试验人员较长时 间与挥发于空气中的试剂相接触,对人体损害较大。近年来,直接浸取法受到重视,张宪政等 用不同配比的混合液对叶绿素进行提取,证明了用混合液提取的可行性。李得孝,吴志旭等 对传统的 Arnon 法进行了改进,将样品冷冻处理后,用50℃丙酮静置提取并进行测定,极大提 高了工作效率。 (1)研磨法。称取0. 5 g 样品于研钵内,加入少量 CaCO3和5 mL 80%的丙酮,将材料充分研磨 细碎直至变白(约5 min),转移至10 mL 具塞离心管中,定容至刻度,摇匀后置于4℃冰箱中静 置12 h,离心10 min (2000 r/min),取上清液测定。(2)直接浸取法。称取0. 5 g 样品放入 10 mL 具塞离心管中,用80%丙酮定容至刻度,于暗柜中静置72 h 浸取,取上清液测定。(3)样 品冷冻后用50℃提取液提取法。称取0. 5 g 样品于10 mL 具塞离心管中,置冰箱中冷冻2h, 取出后加入10mL 在水浴锅中加热至50℃的80%丙酮,充分振摇后于暗柜中静置4h,取上清液 测定。（4）叶绿素计法： 叶 绿 素 计是所有方法中最快捷的，你只需手持叶绿素计，将叶片 插入仪器的感应部位，然后合上测量探头即可。应用于这种测定的仪器又被叫做 便 携 式 叶 绿 素 仪，因为该叶绿素计拥有小巧的机身，仅200g 的重量，可以方便地装入口袋并带到现 场进行测量。 在以上几种测定方法中，直接浸取法提取效果最好,但耗时长,传统研磨法叶绿素的损失较 大,冷冻后用50℃提取液提取法操作简便且提取速度较快,在提取率和稳定性方面均显示良 好的优