土壤脲酶活性的测定.docxVIP

靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性 一、实验原理 靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的 NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生 成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的 NH 4 + －N 含量呈正比，线性范围为 0.05~0.5mg/l 之间。 靛酚蓝反应原理如下: NH 3 + OCl——NH 2 Cl +OH - 三、实验试剂 10%尿素：称取 10g 尿素，用蒸馏水溶至 100ml。 柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）：184 克柠檬酸和 147.5 克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两 溶液合并，用 1mol/LNaOH 将 PH 调至 6.7，用水稀释至 1000 毫升。 苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5 克苯酚溶于少量无水乙醇，加 2 毫升甲醇和 18.5 毫升丙酮，用无水乙醇稀释至 100 毫升（A），存于冰箱中；27 克 NaOH 溶于 100 毫升水（B）。 将 AB 溶液保存在冰箱中。使用前将 2 溶液各 20 毫升混合，用蒸馏水稀释至 100 毫升。 次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为 0.9%，溶液稳定。（9ml—100ml 中） 氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取 0.4717 克硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml， 得到 1ml 含有 0.1mg 氮的标准液。 甲苯 四、实验过程 1.标准曲线的测定 吸取 10ml 氮的标准溶液定容至 100ml，摇匀。从其中分别吸取 0，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00ml 13.00ml 移至 50ml 比色管中，加水至 20ml，再加入 4ml 苯酚钠的溶液，充分混合。紧接着加入 3ml 次氯酸钠，随加随摇匀，放置 20 分钟,用水 稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于 578nm 处，以 1cm 比色皿进行比色测定，以试 剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 2.土样中脲酶活性的测定 分别称取 2g 过 1mm 筛的风干土样于 50ml 锥形瓶中，向其中加入 1ml 甲苯，以使土样全 部湿润为宜。放置 15 分钟后，加入 10ml 10％尿素溶液和 20ml 柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并 摇匀。将锥形瓶放入 37℃恒温箱中，培养 24h。培养结束后，用热至 38℃水稀释至刻度，充 分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。 设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验 中所做的空白对照。 分别吸取（1-3ml）滤液于 50ml 容量瓶中，加蒸馏水至 20ml，充分震荡，然后加入 4ml 苯酚钠，充分混合，再加入 3ml 次氯酸钠充分摇荡，放置 20 分钟，用水稀释至刻度，溶液呈 10 现靛酚的蓝色（在 1h 内保持稳定）。在分光光度计上用 1cm 比色杯，于 578nm 处进行比色测 定。 无土对照：不加土样，其他与实验同，以检验试剂忖度，整个实验设 1 个 无基质对照：以等提及水代替基质，其他与实验相同。 土壤脲酶活性以 24 小时 1g 土壤中 NH3－N 的毫克数表示。 注意事项: 每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以 排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身 分解。 如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样 四、结果计算： 以 24 小时后 1g 土壤中 NH 3 －N 的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。 Ure=（a 样品－a 无土－a 无基质）×V×n／m 式中：a 样品为样品吸光值由标准曲线求得的 NH 3 －N 毫克数； a 无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的 NH 3 －N 毫克数； a 无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的 NH 3 －N 毫克数； V 为显色液体积；n 为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m 表示烘干土重 10