土壤过氧化氢酶、过氧化物酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶测定方法.docxVIP

土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为 专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶 活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根 际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶 活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也 可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物 氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 甲苯 10%尿素：称取 10g 尿素，用水溶至 100ml。 PH6.7 柠檬酸盐缓冲液：184g 柠檬酸和 147.5g 氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏 水。将两溶液合并，用 1mol/LNaOH 将 PH 调至 6.7，用水稀释定容至 1000ml。 苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g 苯酚溶于少量乙醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用乙醇稀释至 100ml（A 液），存于冰箱中；27gNaOH 溶于 100ml 水（B 液）。将 A、B 溶液保存在冰箱中。使用前将 A 液、B 液各 20ml 混合，用蒸馏水稀释至 100ml。 次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为 0.9%，溶液稳定。 氮的标准溶液： 精确称取 0.4717g 硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml，得到 1ml 含有 0.1mg 氮的标准液。绘制标准曲线时，再将此溶液稀释 10 倍供用。 三、操作步骤 标准曲线制作：分别吸取稀释后的标准液 0、1、3、5、7、9、11、13ml，移于 50ml 容量瓶中，然后补加蒸馏水至 20ml。再加入 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min 后显 6 色，定容。1h 内在分光光度计上于 578nm 波长处比色。然后以氮工作液浓度 为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 称取 5g 土样于 50ml 三角瓶中，加 1ml 甲苯。 15min 后加 10ml 10%尿素 溶液和 20ml PH 6.7 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在 37℃恒温箱培养 24 小时。 培养结束后过滤，过滤后取 3ml 滤液加入 50ml 容量瓶中，再加 4ml 苯酚钠溶 液和 3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min 后显色，定容。1h 内在分光光 度计与 578nm 波长处比色。 注意事项: 每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其 他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同， 以检验试剂纯度和基质自身分解。 如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养 的土样 四、结果计算： 脲酶活性以 24 小时后 5g 土壤中 NH  3 －N 的毫克数表示土壤脲酶活性 （Ure）。 NH3－N=（a 样品－a 无土－a 无基质）×V×n／m 式中：a 样品为样品吸光值由标准曲线求得的 NH3－N 毫克数； a 无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的 NH3－N 毫克数； a 无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的 NH  3 －N 毫克数； V 为显色液体积；n 为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积； m 表示烘干土重 土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法） 一、原理 测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。 前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法， 后一种称为无机磷含量法。研究证明：磷酸酶有三种最适 PH 值： 6 使用。 使用。 4~5、6~7、8~10。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应 的 PH 缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的 PH 缓冲 体系有乙酸盐缓冲液（PH5.0~5.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨 基甲烷缓冲液（PH7.0~8.5）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。磷酸酶测定时常用基 质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。 二、试剂 1）缓冲液： a. 醋酸盐缓冲液 PH 5.0 0.2mol/L 醋酸溶液: 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L. 0.2mol/L 醋酸钠溶液 : 16.4g C  2 H  3 O  2 Na 或 27g C  2 H  3 O  2 Na.3H  2 O 溶至 1L。 或者取 14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和 35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至 1L. b. 柠檬酸盐缓冲液