碱裂解法抽提大肠杆菌质粒.pptxVIP

1、实验目的 ： 学习与掌握碱裂解法抽提大肠杆菌质粒DNA的原理与方法 ;2、实验原理： 碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。;3、实验步骤及各步注意事项;2. 加100μl的溶液 I，使菌体充分悬浮，室温静置3min。 注意点：必须充分混匀至看不见沉淀，可用移液器吹打或者用混匀器振荡。;3. 加入200μl溶液II，温和上下颠倒2-3次，溶液转变为澄清透明。 注意点：不可剧烈振荡。;4. 加入150μl溶液III，上下颠倒混匀数次，静置2-3min。 注意点：不可剧烈振荡，此时应出现白色沉淀。 5. 12000 rpm离心5min。;6. 取上清，加等体积（400μl）的酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，室温，12000rpm离心5min。 注意点：酚氯仿有腐蚀性，盖严离心管盖，避免接触酚氯仿，如接触立即用水冲洗。;7. 吸上层水相，再加1ml(约2.5倍体积）预冷的无水乙醇，混匀。 注意点：一定避免吸到中间沉淀及下层酚氯仿。宁可损失一定上清。 ;8. 4℃，12000rpm离心10min。 9. 弃上清，加入0.5 ml 70％乙醇，4℃，12000 rpm离心5 min。 10. 弃上清，沉淀自然干燥10 min后，加20μl无菌水溶解。 注意点：弃上清时尽量将酒精倾倒