莫能菌素残留检测方法标准.doc

―PAGE 12― 莫能菌素残留检测方法标准（试行） 鸡和牛可食性组织中莫能菌素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法（试行） 1.范围 本标准规定了鸡和牛可食性组织中莫能菌素残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于鸡的肌肉、肝脏、肾脏、皮+脂，牛的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中莫能菌素残留量的检测。 2.规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3.原理 试料中的莫能菌素用异辛烷-乙酸乙酯混合液提取，硅胶固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。 4.试剂和材料 以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1 莫能菌素、尼日利亚菌素标准品：纯度≥95%。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 甲醇：色谱纯。 4.4 正己烷：色谱纯。 4.5 乙酸乙酯：色谱纯。 4.6 异辛烷：色谱纯。 4.7 甲酸：色谱纯。 4.8 碳酸氢钠。 4.9 无水硫酸钠。 4.10 中性甲醇：取1000 mL甲醇，加入1 g NaHCO3，充分混合，静置后取上清液使用，如果浑浊则用11 μm滤纸过滤后使用。 4.11 提取溶剂：取4500 mL异辛烷，加入500 mL乙酸乙酯，混匀。 4.12 硅胶固相萃取柱淋洗溶剂：取500 mL乙酸乙酯，加入500 mL正己烷，混匀。 4.13 硅胶固相萃取柱洗脱溶剂：取800 mL乙酸乙酯，加入200 mL甲醇，混匀。 4.14 0.1%甲酸水溶液：取1000 mL超纯水，加入1 mL甲酸，混匀，必要时过滤。 4.15 0.1%甲酸乙腈溶液：取5000 mL乙腈，加入5 mL甲酸，混匀，必要时过滤。 4.16 莫能菌素标准储备液（1 mg/mL）：准确称取含10 mg莫能菌素的标准品，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为1 mg/mL的标准储备液。-20℃保存，有效期3个月。 4.17 莫能菌素中间标准工作液（10 μg/mL）：准确移取适量莫能菌素标准储备液（1 mg/mL），用中性甲醇稀释，配制成浓度为10 μg/mL的中间标准工作液。2～8℃保存，有效期1个月。 4.18 尼日利亚菌素内标储备液（0.5 mg/mL）：准确称取含5 mg尼日利亚菌素标准品，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为0.5 mg/mL的标准储备液。 -20℃保存，有效期3个月。 4.19 尼日利亚菌素添加内标工作液（2.5 μg/mL）：准确移取适量内标储备液（0.5 mg/mL），用乙酸乙酯稀释，配制成浓度为2.5 μg/mL的添加内标工作液。2～8℃保存，有效期1个月。 4.20 尼日利亚菌素校准内标工作液（2.5 μg/mL）：准确移取适量内标储备液（0.5 mg/mL），用中性甲醇稀释，配制成浓度为2.5 μg/mL的校准内标工作液。2～8℃保存，有效期1个月。 5.仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI源）。 5.2 分析天平：感量0.00001g。 5.3 天平：感量0.01g。 5.4 组织匀浆机。 5.5 高速冷冻离心机。 5.6 涡旋混合器。 5.7 振荡器。 5.8 氮吹仪。 5.9 固相萃取装置。 5.10 水浴超声波。 5.11 硅胶固相萃取柱：500 mg-6mL或相当者。 5.12 钢珠：10 mm。 6.试料的制备与保存 6.1试料的制备 取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。 ——取均质的供试样品，作为供试试料。 ——取均质的空白样品，作为空白试料。 ——取均质的空白样品，添加由乙酸乙酯稀释的适宜浓度莫能菌素标准溶液，作为空白添加试料。 6.2试料的保存 -20℃以下保存。 7.测定步骤 7.1提取 称取试料5(±0.05) g，置于50 mL离心管中，加入200 μL尼日利亚菌素添加内标工作液 (2.5 μg/mL)，涡旋混合后静置30 min。 7.1.1 肝脏、肾脏和肌肉组织的提取 向试料中加入15 mL提取溶剂和4个直径为10 mm的钢球，在振荡器中，中速混合5 min。于5000 r/min和4℃条件下离心5 min，移取上清液，于另一50 mL刻度离心管中。向残渣中加入15 mL提取溶剂，重复提取一次，合并2次上清液，用提取溶剂定容至30 mL。加入2.0g无水Na2SO4，涡旋混合5 min，于5000 r/min和4℃条件下离心5 min，取上清液作为备用液。 7.1.2 脂肪组织的提取 向试料中加入15 mL提取溶剂和4个直