第二章3目的基因获得.pptxVIP

第二章 基因工程的基本条件; 三、目的基因的获得; 对已克隆在载体中的目的基因，可根据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择适当的限制酶酶切，获得目的基因。;Ampr; （二）PCR法扩增目的基因;以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。; 30th cycle？;PCR技术的发明--DNA操作技术的革命;1983.03 开汽车时的联想： 蜿蜒崎岖的山路--DNA双螺旋 行驶的汽车--一小段DNA引物;1985.03 Cetus公司申请专利 1985.12 ;1991.12 Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche公司 ;Eppendorf Bio-rad ABI;PCR法扩增目的基因的前提：; ;因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。; （三）从mRNA合成cDNA; 此法适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。 ; 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。;步骤：;钓取目的基因的mRNA：;2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。;克隆平端双链cDNA的方法： ;加装同聚物尾： ;;;CIP去除adapter的5’-P，使5’-P成为5’-OH。;加装衔接物(linker):; 将双链cDNA与linker连接，再用限制酶酶切，可产生粘性末端。 ; （四）化学合成法;已知目的基因的DNA序列。;小片段粘接法 补钉延长法 大片段酶促法 ;1）小片段粘接法： ;2）补钉延长法： ;3）大片段酶促法： ;化学合成的份额较大，成本较高。; 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 ; DNA合成仪是根据固相亚磷酰胺三酯法原理设计的。;;DNA化学合成的用途：;;合成寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)：;大多数氨基酸拥有简并密码子。; （五）通过构建基因文库分离目的基因;是特定生物体全基因组的集合 （天然存在）。;;根据构建方法的不同，基因文库分为：;;1、基因组文库;1、基因组DNA的制备：; 常规方法制备的染色体DNA长度一般100kb，如先将细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1,000kb的DNA片段。; 一般采用超声波和限制酶部分酶切法。;超声波处理： ;产生粘性末端，可与常用克隆位点（如BamH I、Bgl II）连接。;3、载体和受体的选择;;;在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：;基因文库的完备性：;N = ln(1–P) / ln(1–f);即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组克隆的基因文库，若1个基因文库的插入片段总和为整个基因组的10倍以上，就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。 ;基因文库的质量标准：;基因组文库的保存;1）影印滤膜保存法：;2）保存文库于液体培养基中;3）保存单个克隆子于液体培养基中;从基因组文库中筛选目的基因;密集铺板（1-10万）;;“鸟枪法(shotgun)”：又称“散弹法” ;用“鸟枪法”获取目的基因：;;;基因组文库重组克隆的排序;酶切片段末端标记法 随机探针联合杂交法 染色体走读法;酶切片段末端标记法：;2、然后用Sau3A将末端标记的DNA片段降解成碎片，PAGE电泳，每10个YAC克隆走在一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱。 ;3、电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同，二者就有互相重叠的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。;随机探针联合杂交法：;2、用20种探针随机定位杂交（1对1）20份YAC克隆薄膜。若某2个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这2个克隆有可能相互重叠。 ;;;1、从基因文库中任取1个克隆作为染色体走读的起点，将其两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5-2.0kb范围内。 ;2、以亚克隆DNA片段为探针，与基因文库杂交，阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起。 ;3、再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点。 ;;