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荧光定量PCR实验报告 目前需要检测抗癌药A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA，请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。 一、实验原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始 拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。本实验主要采用SYBR荧光染料。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 二、实验试剂和器材因RNA已提取，即应准备反转录和做PCR的试剂： 逆转录酶（M-MLV ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），随机引物（Random primers），琼脂糖（agarose）均为美国Promega 公司产品； 荧光定量试剂盒：Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI公司，合适的抑癌基因A的引物、β-actin引物。 器材： ABI 7300 Real-Time PCR System RS-28高速低温离心机 超低温冰箱 微量移液器 三、实验步骤 1，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点, 用抗癌药A在0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA 2反转录（RT）: 反转录反应液组成如下表： Table 1 Mixed components for synthesis of cDNA first chain Component Volume（?l） Concentration 5×R.T.buffer* 5 1× dNTP 2.5 10?M/??l RNasin 2 20U/??l RNA 5.3 ??g Random Primer 1 0.1ug/??l M-MLV 6 5 U/??l Nucleasr-Free Water 3.2 Total 25 42℃反转录50min，95℃ 5min灭活反转录酶。 3Syber Green 荧光定量PCR检测： 在冰上按下表加样， PCR反应液组成如下表： Table 2 Mixed components for polymerase chain reaction Component Volume （ul） R.T.product 1 2×Master Mix 10 Primer 1+1 H2O 7 Total 20 PCR板的设置如图中所示： PCR热循环参数：96℃ 4min，然后三步反应：94℃ 30S，58℃ 30s，72℃ 30s，进行40个循环，于每个循环的第三步即：72℃ 30s收集荧光信号。最后在72℃ 保温7min。3． 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 四、实时荧光定量PCR结果分析: 扩增完毕后，进入结果分析界面，看CT值、起始拷贝数、标准偏差等，如果是SYBR做的话，再看下溶解曲线。以β-actin为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。 五、注意事项１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。