实验7血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳-仔细阅读后再买.pptVIP

实验十三 血清蛋白醋酸纤维薄 膜电泳 目的 ? 学习醋酸纤维薄膜电泳分离血 清蛋白质的原理和方法 ? 学习蛋白质染色的方法 ? 了解电泳法分离血清蛋白质的 临床意义 原 理 1 、电泳（ electrophoresis ）法 在外电场的作用下，带电颗粒， 例如不处于等电状态的蛋白质分子 带电荷的蛋白质，在电场中将向着 与其所带电荷电性相反的电极泳动 这种现象称为电泳。 电泳影响因素： 蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋 白质所带的电荷性质、数量及质点的 大小和形状；此外还受外界因素的影 响如，电场强度、溶液的 PH 、离子强 度及电渗等。 常见的有： 醋酸纤维膜电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳、 毛细管电泳 醋酸纤维薄膜电泳 ? 醋酸纤维薄膜作为支持介质 ? 醋酸纤维薄膜： 将纤维素的羟 基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮 后制成有均一细密微孔的薄膜， 其厚度为 0.1 ～ 0.15mm 血浆蛋白： (1) 清蛋白（ Alb ）、α1、α2、β、纤维蛋白 原和γ - 球蛋白 ; (2) 血浆中蛋白质的 PI 小于 7.0 ，在 PH8.6 Buffer 中解离成负离子，在电场中向正极 移动。 （ 3 ）在同一 pH 下所带电荷量多少有差异， 各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同， 因而在同一电场中泳动速度不同 。 染色剂： ? 一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮 蓝、丽春红 ? 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸 -Schiff 试剂 ? 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色 白蛋白 a1- 球蛋白 a2- 球蛋白 β - 球蛋白 γ －球蛋白 点样处 醋酸纤维薄膜法显示 血清蛋白质从阳极端起依 次为白蛋白、 a1- 球蛋白、 a2- 球蛋白、 β - 球蛋白 和γ－球蛋白五条区带 。 定量 ? 与蛋白质结合的染料可溶解于 碱液，溶液颜色深浅与蛋白质 量呈正比 ? 比色法比较各蛋白质条带溶于 碱后的溶液颜色，可计算出各 种蛋白质所占的百分比 计算 ? OD 总和 T ＝ A + α1 + α2 + β + γ ? 白蛋白％ ＝ A/T × 100 ％ ? α1球蛋白％ ＝α1/T × 100 ％ ? α2球蛋白％ ＝α2/T × 100 ％ ? β球蛋白％ ＝ β/T × 100 ％ ? γ球蛋白％ ＝ γ/T × 100 ％ 操 作 1 、准备 （ 1 ）电泳仪的准备 （ 2 ）薄膜的准备： ? 在薄膜无光泽面标记点样位置 ? 将薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡 2 、点样 （ 1 ） 无光泽面朝上，吸去多余 Buffer, （ 2 ）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线 处。 注意 ： 不能超出边缘；不能重复点样；必须 与边缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破 薄膜 。 杨 1.5cm 8cm 2cm 3 、平衡： 无光泽面朝下，点样侧位于阴极（ 5min) 4 、电泳： 打开电源， U ＝ 160V 或 I ＝ 1.6mA t=45 － 50min ；冬季 1 小时 5 、染色：氨基黑 10B 染色充分， 5 － 10min 6 、漂洗： 3 － 4 个漂洗皿，洗去染料至背景无色。