第九章目的基因的克隆.pdfVIP

第九讲 目的基因的克隆 吴 乃 虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2005 年 8 月 目 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2 ． “克隆”的不同含义 3 ．基因克隆的过程 4 ．DNA 片段的产生与分离 5 ．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2 ．生物策略 3 ．克隆样品的选择 4 ．基因文库库容测算 三、cDNA 基因克隆 1．概述 2 ．cDNA 文库的构建 3 ．低丰度 mRNA 之 cDNA 克隆 4 ．稀少 mRNA 的 cDNA 克隆 5 ．全长 cDNA 的合成 6．cDNA 克隆的优越性 四、基因组 DNA 克隆 2 1．cDNA 克隆的局限性 2 ．基因组 DNA 克隆的优越性 3 ．构建基因组文库的载体类型 五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2 ．RFLP 分子标记 3 ．RFLP 作图原理与步骤 4 ．染色体步移 5 ．大尺度物理图谱的构建 3 目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定 基因克隆亦叫做 DNA 克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或 DNA 片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的 DNA 群体，并转 化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA 或 DNA 片段混 合物中分离纯化目的基因或特定 DNA 片段的实验操作，叫做基因克 隆。严格地说，基因克隆应叫做 DNA 克隆，因为被克隆的是基因组 的全部(理论上) 的DNA 片段，而并不是所有的 DNA 片段都编码有基 因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆 并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。 因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件 中，常把 “基因克隆”与 “基因分离”等同使用，不作区分，是不 妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的 “分子克隆 ”(Molecular cloning) ，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容， 基因克隆的全过程包括如下四个步骤： 4 a.DNA 材料的选择与片段化； b.外源 DNA 片段与载体分子的连接； c.重组体分子的体外转化； d.转化子克隆的选择或筛选。 2．克隆的不同含义：(动词、名词与形容词) (1) “克隆”的三种含义 *1. “克隆”一词作名词时，是指从一个共同的祖先经无性繁殖 下来的一群遗传上同一的 DNA 分子、细胞或个体所组成的 特定的生命群体； *2. “克隆”一词作动词时，则是指从同一祖先经无性繁殖产生 这类遗传分子上同一的 DNA 分子、细胞群体或个体群体的 过程； *3. “克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使 用，例如 “克隆羊”(cloned sheep)中的 “克隆”便是形容词， 这是中文的一个有别于英文的地方。 (2)名词“克隆”的三个内容 在作名词使用时，“克隆”涉及如下三个方面的内容： a.在胚胎学、免疫学以及细胞生物学等学科中，“克隆”一词是