氨基酸检测方法（可修改）.pptVIP

衍生化后的氨基酸 色 谱 柱 检 测 器 柱前衍生 色 谱 柱 : 反相柱 (ODS) 试 剂 : OPA ( 荧光检测) FMOC (荧光检测) 荧 光 胺(荧光检测) DANS-Cl (荧光检测) PITC (UV) 柱前衍生分离柱 反相色谱柱 (ODS) 使用反相柱，色谱峰分离良好。 分析某些类型的氨基酸所需时间很短 蛋白质水解氨基酸 (20 min) 生物体氨基酸 (60 min) OPA Method(o-phthaldialdehyde) 伯氨基酸 检测 : 荧光检测器 (Ex=380nm, Em=420nm) 反应温度：室温 反应速度：快速 OPA柱前衍生化色谱图 生物体氨基酸标准品 Shim-pack CLC-ODS FMCO 方法(9-fluorenylmethyoxycarbonyl chloride) 通用试剂，用于缩氨酸 N端保护 荧光胺方法 pH＝7时与伯氨基酸快速反应 易于水解 DANS-Cl 方法(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride) 与伯氨基酸和仲氨基酸反应效率低 PITC 方法(phenylisothiocyanate) For peptide and protein sequencing as Edman抯 reagent 伯氨基酸和仲氨基酸 (碱性条件) 反应时间长 使用UV检测器，灵敏度低 PITC PTC PTC - 氨基酸色谱图 STR ODS-II 氨基酸标准品 自动氨基酸分析仪 对于“ 柱前”和“ 柱后”自动氨基酸分析仪来说，采用何种方法更好？ 要控制反应时间，采用柱后衍生方法更方便。 这就是为什么采用柱后衍生法所得结果之重复性更好的原因。 柱后衍生重复性, RSD 约为 1% 柱前衍生重复性, RSD 2% Shimadzu 氨基酸分析系统 氨基酸分析流程图 分离柱 强酸性阳离子交换树脂 (带有磺化基团的苯乙烯－二乙烯基苯共聚物) Na型 and Li型 Shim-pack AMINO-Na ，用于水解氨基酸分析 Shim-pack AMINO-Li ，用于生物体氨基酸分析 水解氨基酸色谱图 生物体氨基酸色谱图 流动相 [ Na型 ] A 溶液 : 0.2N 柠檬酸钠 (用高氯酸调 pH至 3.2) B 溶液 : 0.6N 柠檬酸钠 / 0.2M 硼酸 (用4M NaOH调 pH至 10.0) C溶液 : 0.2N NaOH(用于清洗色谱柱) [ Li 型] A 溶液 : 0.15N 柠檬酸锂 / 7% 甲氧基乙醇 (用硼酸调 pH至 2.6) B溶液 : 0.3N 柠檬酸锂 / 0.2M 硼酸 用4M LiOH调 pH至 10.0) C 溶液 : 0.2N LiOH (用于清洗色谱柱) PH梯度 H H H R-C-COOH R-C-COOH R-C-COO- NH3+ NH2 NH2 分离是通过 离子力进行的 N-acetylcystine作为辅助试剂 什么是氨捕集柱? 流动相中的氨 无捕集柱 有捕集柱 重复性 (各250 pmol) (n=10) 线性 高灵敏度分离色谱图 25 pmol 氨基酸标准品 样品预处理 脱脂 去蛋白 蛋白质水解 样品稀释 过滤 脱脂 脂类组分会影响分析柱 使用弱极性溶剂 乙酸乙酯 氯仿 正己烷等 两相分离后, 水相必须使用0.45 um 滤膜过滤 除蛋白 蛋白组分会干扰氨基酸的分离 除蛋白试剂 酸性溶剂方法 有机溶剂方法 超滤方法 蛋白沉淀物必须采用离心 (3000 rpm, 5 min) 或过滤方法除去. 酸性溶剂方法 三氯乙酸 (5-10% 水溶液) 高氯酸 (0.1 - 1% 水溶液) 除去蛋白后, 通过加 NaOH or LiOH 以中和溶液 (溶液呈酸性时会影响色谱保留时间.) * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 氨基酸分析 1958 Spackman, Stein and Moore 第一次实现氨基酸自动分离和定量 NH2 R C COOH