植物组织培养实验之具体配置.pptxVIP

植物组织培养实验;实验一 培养基贮备液（母液）的配制;一，MS培养基的组成;2、微量成分→贮备液II mg/L KI 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4 4H2O 22.3 ZnSO4 7H2O 8.6 Na2MoO4 2H2O 0.25 CuSO4 5H2O 0.025 CoCl2 6H2O 0.025 ;3、铁→贮备液III mg/L FeSO4 7H2O 27.8 Na2 EDTA 2H2O 37.3 4、有机成分→贮备液IV mg/L 肌醇 100 烟酸 0.5 盐酸硫胺素(VB1) 0.1 盐酸吡哆醇 0.5 甘氨酸 2 ;二，常用生长调节剂;三、作业：;贮备液I(g);实验二 固体培养基的配制与灭菌 ;称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量的琼脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L），置于大烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右，（加热）使之溶解。 混合：分别加入一定量的贮备液I、II、III、IV和生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至需配培养基的终体积。 调pH值：充分混合后，在60℃水浴条件下用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH值至5.8。 灭菌：封严培养容器口后，120 ℃灭菌20 min后，将培养基取出，置于水平台子上，在室温下冷却，备用。;实验三 外植体材料的预处理、消毒及接种;二、方法步骤： ; （二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100 ml水）等浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一步减少污染的处理。 同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。;;（四）??? 操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。 ;（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100 mL消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5 cm），开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。 ;（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。 ; （七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。 逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。如有必要，也可再行切分。在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。 ; （八）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒