第五讲 基因芯片检测技术.pptVIP

. 像素与分辨率 像素是构成图像的最小单元，即图像上不同颜色或灰度的点，这些点组合起来形成一幅完整的图像。在CCD上为CCD的最小感光单元，其大小通常在几个微米到十几个微米，通过成像公式可换算成检测芯片上对应区域的大小。对于激光系统，像素的大小为激光光斑的尺寸，可以通过改变光斑直径来改变像素的大小。 分辨率是指能够区分的最近两个点的最小距离 。 像素的大小决定了分辨率的高低，像素越大，分辨率越高，分辨率越高则图像越清晰，定量的准确度就越高，可以提供更精细的具有统计意义的数据。 像素与分辨率 激光系统扫描仪的分辨率主要是由激光的聚焦直径决定的，分辨率一般为5～10μｍ。CCD系统扫描仪的分辨率主要决定于CCD像素的数目，一次成像型CCD扫描仪的分辨率一般为大于或等于20μm，多次扫描拼接成像型则可达2.5μm。 扫描仪 控制和自动化系统是由电脑来完成的 。 图形化的操作界面使得初学者只需接受简单的训练或阅读操作手册就能够使用仪器，因此扫描仪使用者并不需要精通扫描仪的光学和电子学部分 控制软件具有许多自动设置功能，如不同的用户扫描不同样品可设置、保存、再现扫描参数；可自动设定2个以上的扫描激光波长并自动保存图像结果；对某一扫描波段自动调整灵敏度、激发光强度、及探测器探测范围等。 商品化生物芯片扫描仪 激光共聚焦扫描仪 — ScanArray系列、SureScan芯片扫描仪、DNAscope? 系列。 激光非共聚焦扫描仪 — GenePix 系列 CCD基因芯片检测仪 — AlphaArrayTM 基因芯片扫描分析系统、GeneTAC扫描仪、SpotWare 基因芯片扫描仪 、ArrayWoRx“e”扫描仪 国产扫描仪 —成都中科百奥科技有限公司 SCAN-1、北京博奥生物芯片有限责任公司EcoSCANTM-100? 扫描过程应注意的问题 由于芯片扫描仪有极高的灵敏度和分辨率，芯片上很小的尘埃或杂质污染都会引起非常明亮的背景和噪音，因此在芯片的制作，杂交和清洗过程中都应在洁净的环境中进行，最好在洁净台或者洁净间操作，并注意防静电。 芯片完成杂交和清洗后应尽可能立即扫描测定，防止荧光标记靶分子降解。杂交后的芯片应避免长期暴露在强光下，因而导致光漂白，影响测定结果。 芯片扫描中由于有机械传动装置，因此仪器应放置在平稳坚固的平台上，并注意防止外源性震动。 芯片图像处理 灰度图 最原始的图谱是黑白的，显现的是灰度值，一般扫描仪所得到的图谱为16位的Tif、Jpeg、Raw等格式的图像（也有些扫描仪能得到更高的24位的图像），每个像素的灰度值在0-65535之间的范围内，每个灰度值都反应了图像所对应芯片位置的荧光分子相对强度信息。 伪彩图 在扫描仪配套的扫描软件中一般都内建有能将原始的灰度图改为伪彩图的功能。由于肉眼对区分同种颜色的不同强度（灰度）并不敏感，因此就人为的将灰度值根据其数值大小转化成不同颜色，以便于肉眼观察扫描图谱时便能一目了然的区分出同一张芯片上各种基因的相对信号强弱。 叠加图 对于基因表达谱芯片，为了便于扫描完毕就能大致判断芯片中是否有上调或下调的差异基因，有些扫描或分析软件中还提供叠加图的功能。它是将同一张芯片所对应的两种不同杂交样本扫描所得图谱分别转变成绿色和红色的图谱。一般对照样本（通常用Cy3标记）被转变为绿色，而实验样本（通常用Cy5标记）被转变为红色。当两张图谱叠加在一起时，每个基因点的最终色彩由两种颜色的比率而决定， 如果点的颜色为红色，说明该基因在实验样本中的表达量比对照样本中的表达量高，该基因为上调基因；如果最终基因点的颜色为绿色，则该基因在实验样本中的表达量比对照样本中的表达量低，该基因为下调基因；如果最终基因点的颜色为黄色，该基因没有显著变化。 多Block的芯片 芯片图像上的点象格子一样排列。有些芯片的图像还包括几个部分，每个部分含有相同行和相同列的点的子格，并且每个子格之间的距离大概相等，所有的子格合在一起就是一整张芯片。 理想的芯片图像 理想的芯片图像：（1）所有子格大小相同。（2）子格之间距离相等。（3）子格中行和列之间的距离应当相等。（4）点中心的位置应在行线和列线的交点处。（5）点的形状是个圆，并且所有圆的大小相同。（6）片子上没有灰尘或者其他污染。（7）图像背景均一而且值很小。 实际情况和这种理想情况往往有很大偏离。 实际的偏离 点位置偏移：原因在于芯片生产过程中的机械方面。每个点之间的间隔可能会不一致。另外还有机器人系统，点样仪器的不精确和放置片子的托盘的稳定性不好，还有一些点位置不易确定。 点大小和形状不规则：点样时DNA溶液的液滴大小不同，导致点的大小也不同。另外，液滴中DNA浓度和盐的浓度不同，点的形状可能与圆相差很大。在一个点所对应的圆内