分子生物学实验操作方法与技巧.pptVIP

分子生物学与生物化学实验 操作、设计与技能 电泳技术 李刚 副教授 contents 影响迁移率的几大因素 2 电泳的原理 1 低熔点琼脂糖的优点 3 不同类型琼脂糖分离 DNA 片段的范围 4 电泳缓冲液 5 contents 电泳步骤 7 凝胶载样缓冲液 6 凝胶中 DNA 定量的方法 8 两种核酸染色方法 9 电泳的主要用处 10 contents 电泳切胶小窍门 12 核酸回收的几种经典方法 11 电泳的原理 ? 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。 ? 利用带电样品分子（ DNA 、 RNA 、蛋白质等） 在电泳装置中的支持介质上（琼脂糖、聚丙 酰酰胺等）迁移率（带电荷颗粒在一定电场 强度下，单位时间内在介质中的迁移距离） 的不同而将样品中不同大小的分子分离开。 影响迁移率的几大因素 ? 1 、 DNA 分子的大小。 分子越大，迁移得越慢。 ? 2 、琼脂糖浓度。 给定大小的线性 DNA 片段在越低 浓度琼脂糖的凝胶中迁移率越快。 ? 3 、 DNA 的构象。一般超螺旋 DNA （ I 型 ) 切口环 状 DNA 线状 DNA ， 但在一些情况下，顺序可能 颠倒 。所以确定 DNA 的大小，很多时候要依靠 Marker （分子量标记）。 ? 4 、溴化乙锭（ EB ） 。 EB 插入双链 DNA 造成其负电 荷减少、刚性和长度增加。因此线状 DNA －染料复 合物在凝胶中的迁移率约降低 15 ％。 影响迁移率的几大因素 ? 5 、所用的电压。 低电压时， DNA 片段迁移率与 所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子质 量片段的迁移率不成比例的增加。所以当电压增 大琼脂糖凝胶所分离的有效范围反而减少。要获 得大于 2 Kb DNA 片段的良好分辨率，则 所用电 压不得超过 5 － 8V ／ cm 。 ? 6 、琼脂糖种类 。常见的琼脂糖主要有两种：标准 琼脂糖 (Agarose) 和低熔点琼脂糖（ LMP Agarose ）。一般低熔点琼脂糖比标准琼脂糖具 有更佳的分辨率。 琼脂糖品牌的推荐 ? 一般来说，琼脂糖的品牌对电泳结果影响不大， 但好的琼脂糖做出来的胶韧性比较好，照出来的 照片效果好，很清晰，背景很干净。 ? 推荐：最好用的琼脂糖品牌 ： Sigma ，日本的一 些牌子，强度也很高。性价比比较高的有 BioWest Agarose （西班牙品牌），这几乎是目 前国内使用最普遍的一种琼脂糖。另外， Promega 的 Agarose 不好用，强度较差。 Agarose 和 Agar 的区别 ? 注意： Agarose 和 Agar 的区别： ? 琼脂糖（ Agarose ）是经过挑选，以质地较纯的琼脂 （ Agar ）作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖 和琼脂胶组成的复合物。 琼脂胶是一含有硫酸根和羟基的 多糖，它具有离子交换性质，这种性质会给电泳及凝胶过 滤以不良的影响。琼脂糖是直链多糖，它由 D- 半乳糖和 3,6- 脱水 -L- 半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖主要通过 氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（ 98 － 99% ）， 近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快， 区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响 很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。 ? Agarose 一般仅用于电泳实验 ，当然如果不怕浪费的话， 也可以用于配固体培养基。效果很好！ ? Agar 一般仅用于配固体培养基 ，绝对不能用于电泳！ 低熔点琼脂糖的优点 ? 标准琼脂糖一般凝结温度在 40 － 42 ? C ，熔化温度 在 85 － 90 度。低熔点琼脂糖一般凝结温度在 25 － 35 ? C ，熔化温度在 63 － 65 ? C ，甚至更低。一般 在 30 － 35 ? C 仍呈液态， 所以在回收胶内的 DNA 时， 加热溶解胶后不损伤 DNA 。另外 它比标准（普通） 琼脂糖有更高的筛分能力。其分辨率接近聚丙烯酰 胺凝胶 ，因此可用于 PCR 产物、小片段 DNA 和小 RNA （ 1kb ）的分离。现在 它能分辨少至 4bp 的 DNA 和分离 200 － 800bp 范围内相差 2 ％的 DNA 片 段。 ? 但低熔点琼脂糖价格非常昂贵，远高于标准琼脂糖。 不同类型琼脂糖分离 DNA 片段的范围 ? 琼脂糖／％ 标准 高强度 低熔点 低黏性低熔点 ? 0.3 ? 0.5 700bp-25kb ? 0.8 500bp-15kb 800bp-10kb 800bp-10kb ? 1.0 250bp-12kb 400bp-8kb 400bp-8kb ? 1.2