凝胶层析分离技术.pptVIP

3 、凝胶装柱 。 ①将层析柱垂直装载支架上， 将下端输液管夹紧； ②向柱中加入约 1/3 体积的 0.9 ％ NaCl 溶液； ③将一细玻棒伸入柱内，靠近 管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内 加入混匀的凝胶溶液； ④凝胶加至层析柱顶端约 3cm 时，打开柱下端输液开关，使流 速控制在 0.25-0.5ml/cm 2 ·nim。 ④连续而缓慢的加凝胶直到稳 定在离管口约 5cm 处。 （防止空气进入凝胶床） 4 、样品上柱及洗脱 ①加样量的控制 分析： 1-2ml/100ml 床体积， 制备： 10-30ml/100ml 床体积 ②洗脱液的选择： 洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶 液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而 影响分离效果。 ③凝胶层析加样 操作示意图 ④洗脱与自动收集 记录 ⑤凝胶柱层析 实物 连接 ⑥凝胶层析中的 分离行为 第十章 凝胶层析法 第十章 凝胶层析法 第一节凝胶的条件和类型 第二节基本原理 第三节 凝胶层析的实验技术 第四节 凝胶层析的应用 第一节 凝胶的条件和类型 ? 层析凝胶必须具备下列条件： ? 凝胶层析中常用凝胶类型 层析凝胶必须具备下列条件 1. 凝胶必须是化学惰性的 2. 凝胶的化学性质必须是稳定的 3. 凝胶上没有或只有极少量的离子基团 4. 凝胶必须具有足够的机械强度 凝胶层析中常用凝胶 葡聚糖凝胶 ( dextran gel ， Sephadex ) 聚丙烯酰胺凝胶 ( polyacrylamide gel ， Bio-Gel P ) 琼脂糖凝胶 ( agarose gel ， Sepharose ) 琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶 ( Superdex ) 葡聚糖凝胶部分结构 葡 聚 糖 凝 胶 部 分 结 构 (Sephadex ) 聚丙烯酰胺凝胶 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 部 分 结 构 (Bio-Gel P ) 琼脂糖凝胶 (Sepharose) (Sepharose) 琼脂糖凝胶的部分结构 第二节 基 本 原 理 一、凝胶的结构与分子筛效应 二、凝胶床总体积 三、分配系数（ Kd ） 四、有效分配系数（ Kav ） 五、分子量与 Ve 的关系 一、凝胶的结构与分子筛效应 动画演示 二、凝胶床总体积 Vt ：柱床 “总容积”， Vo ：即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的 水相容积 Vi ：即凝胶颗粒内部所 含水相的容积。 Vg ：凝胶本身的容积； Vt ＝ Vo 十 Vi 十 Vg 或 Vt-Vo = Vi 十 Vg ， 三、分配系数（ K d ） 0 ＜ K d ＜ 1 ， Ve 在 Vo 与 Vo 十 Vi 之间变化 Ve ：为实际测得的洗 脱容积，自样品加入 到组分最大浓度 ( 峰 ) 出 现时所流出的容积； Vi Vo Ve Kd ) ( ? ? V e ＝ V o 十 K d V i 四、有效分配系数（ K eff ） ） （ ） （ 0 0 V V V V K t e eff ? ? ? Vi Vo Ve Kd ) ( ? ? 将 Vt-Vo 代替 Vi ，则： 即： Ve ＝ Vo 十 K eff (Vt-Vo) 实际上， K eff 是 将以水作为固定相 (Vi) 改为水与凝胶颗粒 (Vt-Vo) 作为固 定相，而洗脱剂 (Ve-Vo) 为流动相。 Kav 与 Kd 对交联度小的凝胶差别较小， 而对交联度大的凝胶差别大。 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过 Vt 体积后， 所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点， 五、 Ve 与相对分子量的关系 Ve=K 1 -K 2 lgM K 1 、 K 2 为常数， Ve 可用如下表达 式代替， Ve-Vo （分离体积）， Ve/Vo （相对保留体积）， Ve/Vt （简化洗脱体积）， K eff （相对洗 脱体积） 在不同型号凝胶上蛋白质 的选择曲线的 差异 第三节 凝胶层析的操作技术 一、凝胶的选择与处理 二、凝胶装拄制备 三、样品上柱及洗脱 四、实验操作 五、凝胶柱的保养和凝胶的保存 一、凝胶的选择 ? 排阻范围与粒度的选择 ? 凝胶用量的计算 排阻范围的选择 粒度的选择 粒 度 的 选 择 凝胶用量的计算 干凝胶用量（ g ）： πr 2 h/ 膨胀度 （膨胀度： 床体积 / 克干胶） 理论用量×（ 1+10% ）凝胶的处理 Sephadex G-25 G-75 G100 G-150 G-200 （中）湿球粒度 μm 100- 200 120- 200 20- 200 120- 200 120- 200 吸水值 ml/g 干胶 2.5 ± 0. 2 7.5 ± 0. 5 10.0 ± 1 .0 15.0 ± 1. 5 20.0 ± 2 .0 床体积 ml/g 干胶 4-