核酸检测及相关技术.ppt

核酸检测及相关技术;内容; （一）核酸提取;基因组DNA提取基本步骤;1、材料准备;取组织块 0.3-0.5cm3剪碎，加TE缓冲液0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 将匀浆液转移到1.5 ml离心管中。 加20% SDS 25 μl，蛋白酶K(2 mg/ml)25 μl，混匀。 60 ℃ 水浴1-3 h。;液氮研磨组织注意事项; 培养细胞处理：; 外周血的处理;分离单个核细胞 Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺） 密度梯度离心法，因为血液中各有形 成分的比重存在差异，因此得以分离。 红细胞和粒细胞密度大于分层液，同 时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。 ; 细菌的处理;核酸分离、沉淀、洗涤和溶解;质粒DNA的提取; 材料准备;当用碱处理DNA溶液时，变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而共价闭合环状的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象