PCR原理及其操作概述.pptVIP

PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。 此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。 理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。 由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。 以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。 PCR扩增曲线 PCR反应五要素 1. 引物（primer） 2. 酶 （Taq DNA polymerase） 3. dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4. 模板 （template） 5. Mg2+ （magnesium） 1.引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 引物设计的原则 ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； ③引物碱基：G+