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将已知顺式作用元件构建到最基本启动子 （ minimal promoter ， Pmin ）的上游，把 报告基因连接到 Pmin 下游。将编码待测转录 因 子 c DNA 与 已 知 酵 母 转 录 激 活 结 构 域 （ transcription-activating domain, AD ） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如 果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin 启动子，使报告基因得到表达。 图 6-15 酵母单杂交的基本原理示意图 图 6-16 从拟南 芥 cDNA 文库中 筛 选 与 顺 式 元 件 DRE 结 合 的 转 录 因 子 示 意 图。 6. 3. 2 酵母双杂交系统（ Yeast two-hybrid system ） 真 核 生 物 转 录 调 控 因 子 具 有 组 件 式 结 构 （ modular ）特征，这些蛋白往往由两个或两个以 上 相 互 独 立 的 结 构 域 ， 其 中 D NA 结 合 结 构 域 （ b inding domain ， B D ） 和 转 录 激 活 结 构 域 （ activation domain ， AD ）是转录激活因子发挥 功能所必须的。 BD 能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转 录，由不同转录调控因子的 BD 和 AD 所形成的杂合 蛋白却能行使激活转录的功能。 图 6-17 酵母双杂交技术原理示意图 6. 3. 3 体外蛋白质相互作用技术 1 、 Far Western 印迹技术 用 32 P 标记的体外表达蛋白作探针 , 直接检测 与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白 的 cDNA 。 图 6-18 Far Western 印 迹试验 2 、 GST 融合蛋白沉降技术 利用 GST 对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲 和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作 用蛋白。 图 6-19 GST 融合蛋 白沉降技术流程。 3 、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的 相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质 芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可 以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相 互作用蛋白点 。 4 、等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米 级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过 时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相 互 作用，那么两者的结合将使金属膜表面 的折 射率上升，导致共振角度的改变。 图 6-21 等离子表面共振技术示意图 5 、免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可 能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入 反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法 在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合 物沉淀到试管的底部或微膜上。 免疫共沉淀 示意图 6. 3. 4 细胞内蛋白质相互作用研究 — 荧光共 振能量转移法（ FRET ） FRET 荧光能量转移有三个基本条件： （ 1 ）给体与受体在合适的距离 （ 1 ～ 1 0 nm ）； （ 2 ）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有 一定的重叠（这是能量匹配的条件）； （ 3 ）给体与受体的偶极具有一定的空间取 向（这是偶极 - 偶极耦合作用的条件）。 图 6-23 荧光共振能量转移法 FRET 需要有两个探针，即荧光给体和荧光 受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光 谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量 没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不 同，可根据需要组成不同的探针对。常用的 探针有： 荧光蛋白 传统有机染料 镧系染料 荧光蛋白，一类能发射荧光的天然蛋白及其 突变体。 传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的 有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗 丹明类化合物和青色染料 Cy3 、 Cy5 等。 镧系染料，金属染料。一般与有机染料联 用，分别作为 FRET 的给体或受体，以提高检 测的准确性和信噪比。 第 六 章 分子生物学基本研究法 （下）基因功能研究技术 6. 1 基因表达研究技术 6. 1. 1 基 因 表 达 系 列 分 析 技 术 （ Serial Analysis of Gene Expression ， SAGE ） 是以 DNA 序