非标记生物物理技术在分子相互作用领域的应用.doc

非标记生物物理技术在分子相互作用 领域的应用 通用电气医疗集团生命科学部 应用工程师 韩佩韦 博士Peiwei.han@ 400-810-9118 2014.6.30 内容简介 一、非标记生物物理技术概述 二、Biacore原理及在蛋白互作和药筛中的应用 三、微量热技术简介 四、QA 2 / GE Title or job number / 2014-06-30 生命过程由无数个分子相互作用组成 生物分子互作网络一角 HIV病毒入侵宿主直至成熟的全过程 3 / GE Title or job number / 2014-06-30 常见的分子相互作用例子 1. 配体与细胞表面受体的相互作用； 2. 转录因子对核酸关键序列（如启动子、增强子等）的调节； 3. 低分子量的“第二信使” 与生物大分子之间的相互作用； 4. 蛋白质复合体多个亚基之间的组装与调节； 5. 免疫反应中T cell与病原体表面抗原之间的识别； 6. 酶分子与其激活剂或者抑制剂之间的相互作用； 7. 生物分子在质膜与核膜之间的转位及调节； … … 4 / GE Title or job number / 2014-06-30 常用的分子互作技术 对于涉及蛋白质相互作用的研究 1. 酵母双杂交 2. 酶联免疫吸附分析（ELISA） 3. 荧光共振能量转移（FRET） 4. 免疫共沉淀（Co-IP） 5. 免疫印记（Western, Far-Western） 6. 质谱技术（Mass Spectrometry） 对于涉及核酸相互作用的研究 1. EMSA 2. ChIP （染色体免疫沉淀法，Co-IP的类似技术） 5 / GE Title or job number / 2014-06-30 目前分子互作技术的特征 1. 终点技术（End-point Tech） 酵母双杂，ELISA，Co-IP，ChIP，Western，MassSpec. 2. 需要标记（Require Labeling） 酵母双杂，ELISA，FRET 3. 检测强亲和力的相互作用 ELISA，Co-IP，ChIP，Western，MassSpec，EMSA 3. 耗时费力（Laborious） ELISA，Western，EMSA 4. 非活性或半活性互作（Inactive OR Semi-active Tech） ELISA，Western，MassSpec，EMSA 5. 信息量较少 有/无信息，以及ELISA的亲和力信息 6 / GE Title or job number / 2014-06-30 非标记分子互作分析平台 （表面等离子共振及微量热技术） 7 / GE Title or job number / 2014-06-30 亲和力 (Affinity, KD) 弱结合 中等强度 强结合 mM 10-3 μM 10-6 nM 10-9 ? 亲和素-生物素结合: 10?14 M ? 强的抗原-抗体结合: 10?8~10?10 M ? DNA与蛋白的结合: 10?8~10?10 M ? 较弱的抗原-抗体结合：10?6~10-7M ? 酶与底物结合： 10?4~10?10 M ? 蛋白与小分子药物结合：10?3~10?6M 8 / GE Title or job number / 2014-06-30 Bi acor e 实时监测分子间相互作用 Bio-molecule Interaction Analysis core-technology Bi acor e?能够做什么？ Biacore – Bio-molecule interaction analysis core tech的缩写词，是一种 基于表面等离子体共振原理的生物芯片传感器技术。 小分子 确认存在 Biacore 测量分子间 结合 直接测定 无需标记 肽段 蛋白 核酸 脂类 活性浓度 动力学 亲和力 结合方式 … … 10 / GE Title or job number / 2014-06-30 Bi acor e基本原理-表面等离子共振 analyte MW R ? ? ? max R S L m ligand MW 11 / GE Title or job number / 2014-06-30 传感图（基线水平） 160 140 120 100 80 60 40 1 20 0 0 100 200 300 400 500 -20 Time (s) baseline injection Buffer flow buffer sample buffer 1. 在固定好药物靶标的芯片上用缓冲液建立基线 12 / GE Title or job number / 2014-06-30 传感图