演示版抗体噬菌体展示技术.pptVIP

Competitive Deselection Antigens from a particular pathogen can be of variable immunogenicity, with the antigen that stimulates the strongest response being the immunodominant one.? To obtain antibodies against the epitope of interest, a preadsorption panning is used. This facilitates the molecular cloning of Mab fragments against non-immunodominant Ag determinants. The phage library is first preabsorbed on the Ag of interest to remove phage that react with the immunodominant epitope. The unbound phage are then incubated a second time with Ag and eluted and amplified according to normal protocols. ., * Epitope-masking Strategy ., * Capture-lift Screening procedure ., * 第二种，一种叫竞争性淘汰的筛选方法，因为一个抗原上通常有多个抗原决定簇，但是某些抗原决定簇存在这免疫优势，或者叫免疫显性。就是说绝大多数抗体是针对该抗原决定簇的。如果想得到针对那些非免疫显性的抗原决定簇的抗体，就要采用一些特别策略。比如说使用这种竞争性淘汰的方法， 利用预吸附淘选，去除那些免疫显性的抗体，留下的抗体再进行第二次淘选。 精选 课件 第三种是，抗原决定簇遮盖法，比如一个抗原上有两个抗原决定簇，A和B，A是那个dominant epitope，首先在第一轮里我们先晒出来针对A的抗体，然后得到噬菌体抗体后，把抗体切割下来得到可溶性A抗体，用这些抗体，将A抗原决定簇封闭掉，再来筛选针对B抗原决定簇的抗体。 精选 课件 第四种是，Capture-lift screening procedure，中将硝化纤维素滤膜与捕获试剂孵育，然后阻断其余的非特异性结合位点，将转染过噬菌体的细菌培养平板覆盖上这个消化纤维素滤膜，大概12-14个小时，之后去掉滤膜，用标记的抗原探针孵育。所以可以通过探针得出哪些是A抗原特异性的，哪些与B或者C有交叉反应性。然后根据这个滤膜上标记的位置，分离得到感兴趣的克隆。这种方法可以同时分析上千个抗体克隆进行分析，并且适合用于得到那些比较独特的抗原表位特异性的抗体。 精选 课件 第五种，capture-sandwich ELSIA 的筛选方法。一般的筛选方法是要对抗原进行纯化的，但是这个过程比较浪费时间也比较繁琐，所以这种capture-sandwich ELISA的方法就避免了对抗原进行纯化。用到了两个抗体，一个用于捕获一个用于检测。跟sandwich ELISA步骤相似，先将捕获抗体包被在板子上，之后封闭，加入抗原溶液，之后再加入Fab-展示抗体，洗掉非特异性结合的，剩下的噬菌体抗体用来侵染细菌，繁殖扩增。 这种方法除了不需要纯化抗原，还有其他优点，例如说他不会对抗原的构象产生影响，而且通过使用不同的捕获抗体，我们可以得到针对不同抗原表位的噬菌体抗体。比如说，我们使用的捕获抗体是针对A这个免疫显性抗原表位，那就可以得到针对B表位的抗体。 精选 课件 第六种是叫做，临近抗体定向选择。他用到了一种信号放大的方法，叫做催化报告酶沉积。它的原理是利用辣根过氧化物酶，能够在底物过氧化氢存在的情况下，对生物素酪胺催化，产生自由基，自由基与附近的蛋白结合，使蛋白生物素化。所以这种方法里就用辣根过氧化物酶标记的二抗来定位到筛选的抗体上，然后通过磁珠进行回收。这种方法适合用来筛选分离针对细胞表面靶蛋白的抗体。 精选 课件 第七种，是利用磁性细胞分选技术，将带有靶蛋白的目标细胞，预先生物素化连接上磁珠。在筛选的时候，不仅加入这种靶细胞，还加入过量的Ag-negative 细胞，就是不含靶蛋白的 阴性细胞进行负筛选。所以这种方法是将负筛选和正筛选结合起来，一同进行。通过磁珠来分离得到特异性抗体。 这个方法比单纯使用好几轮的负向筛选要更有用一点，因为重复好几轮的负向筛选有可能会把目标抗体筛没了。 精选 课件 首先是可以筛选不同亲和性的抗体，或者是抗体的结合动力学；其次是，筛选具有不同生物活性或