酵母双杂交原理介绍.doc

酵母双杂交技术 酵母双杂交技术 ? 酵母双杂交系统( two-hybrid system) 也叫相互作用陷阱 ( interaction trap)，是 1989年由 Song和Field基于酵母的细胞内检 测蛋白间相互作用的遗传系统建立 的。 ? 酵母双杂交技术是一种有效的真 核活细胞内研究方法，在蛋白质相 互作用的研究方面得到了广泛的应 用并取得了许多有价值的重要发现。 在此基础上又发展了反向双杂交， Stanley Field 三杂交及核外双杂交等多项技术。 酵母双杂交技术的提出 2.酵母双杂交原理介绍 ? 酵母中，半乳糖代谢所需的基因被两个调节蛋白 所控制：GAL4，GAL80 ? 当存在半乳糖时，GAL4蛋白与UAS上游的基因中 的GAL4效应元件结合，激活转录。 ? 不存在半乳糖时，GAL80结合GAL4阻碍转录激活。 2.酵母双杂交原理介绍 ? 完整的酵母转录因子GAl4分为结构上可以分开的、 功能上又相互独立的2个结构域。 ? 一个是位于N端1-174位氨基酸残基区段的DNA结 合域（DNA binding domain, DNA-BD）。 ? 另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区段的 转录激活域（Activation domain，AD）。 酵母双杂交技术原理 ? 很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具 有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域 （DNA-binding domain，BD）与转录激活域 （Transcriptional activation domain ，AD）。 这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完 整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含 有这两个结构域,否则无法完成激活功能。 酵母双杂交系统组成 酵母双杂交系统由三个部分组成： (1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵 蛋白(bait)； (2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶 蛋白(prey)； (3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报 告基因有HIS3，URA3，LacZ和绿色荧光蛋白等 www.them .com 2.酵母双杂交原理介绍 ? 一个酵母双杂交系统包括3个部分： ? 带有1个或多个报告基因的宿主菌株； ? 与GAL4-BD 融合表达蛋白，被表达的蛋白称为旅 馆诱饵蛋白（bait）； ? GAL4-AD 融合表达载体，被表达的蛋自称为靶蛋 白（prey）。 2.酵母双杂交原理介绍 ? 将可能存在相互作用的2种蛋白质，即已知蛋白X 和待研究蛋白Y，分别作为诱饵(bait)和猎物 (prey)，并分别和BD／AD在空间结构上重新连接 为一个整体而与报告基因的上游激活序列(UAS)结 合 ? 如果X和Y之间可以形成蛋白-蛋白复合物，使 GAlA2个结构域AD和BD相互接近，表现出转录因 子的活性从而启动转录，使UAS下游启动子调控 的报告基因得以表达。 ? 反之，如果诱饵和猎物之间不存在相互作用，BD 与AD就不能结合，报告基因则不能被启动表达。 2.酵母双杂交原理介绍 3.酵母双杂交的应用 ? 发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 ? 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 ? 筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互 作用的影响 ? 建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）