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實驗二:沙門氏菌之檢測
一﹑意義:
沙門氏菌為G(-)桿菌,除Salmonella pullorma及S.gallinarium外,均帶週鞭毛具運動性,一般不具莢膜。在水中耐寒,且對煌綠(Brilliant green)﹑四硫酸諷(Sodium tetrathionate)及膽酸諷(Sodium deoxycholate)有耐性,所以這些藥劑常用來選擇性培養沙門氏菌。沙門氏菌中毒原因係因攝食感染此菌得肉類﹑蛋類﹑乳類或氮白質含量高的食品而引起中毒,係感染性中毒,當檢驗食品中此菌感染量達105-108 CFU/g,即可能致病。檢驗食品中是否含有此菌的步驟有:
(一)增菌培養:將樣品置於Lactose broth或Buffered peptone water中,使菌量增加以利檢驗之進行,其目地為使已受傷致活性降低之菌體能予以復活恢復。由於此兩種培養基是屬於非選擇性之復活培養基,雖適用於多數食品,但當由大量G(+)菌如乳鏈球菌(Streptococcus lactis)存在時易發生干擾現象,可在培養基中添加0.002% (W/V)煌綠(brilliant green)或0.004%結晶紫以克服此干擾現象。
(二)選擇性增殖:利用亞 酸鹽胱胺酸肉羹(Selenite cystine broth)及四硫代硫酸鹽肉羹(Tetrathonate broth)來抑制大腸桿菌等雜菌,使沙門氏菌能被選擇性增殖。
?Selenite cystine broth:本培養基所添加的酸性亞矽酸鈉(Acid Sodium Se-lenite;NaHSeO3)是扮演選擇性增菌作用之主要角色。即SeO3 由於菌體之酵素作用而變成二價之Se+2,該Se+2 取代含硫胺基酸中硫而變成Selenomethionine或Selenocysteine而殺死試驗菌株,但對於某些菌種(如Salmonella),SeO3 因酵素作用能將二價之Se 還原,並可依其還原能力差異來影響菌種之選擇性。本培養基係針對並利用沙門氏菌與大腸桿菌對亞矽酸鹽還原能力之強弱,由於酵素活性之差異,沙門氏菌比大腸桿菌要快速將SeO3 還原至不活性的Se。二價Se在pH8.0-8.5之鹼性範圍比7.0-7.4時具有較強烈地發育阻礙作用,24小時以內時則沙門氏菌的發育也會被抑制,添加磷酸鹽使具有緩衝作用,可防止培養基因菌體之發育與伴隨亞 酸鹽之還原而變成鹼性,且對因為E.coli分解乳糖所產酸有會發生中和作用。切記的是:亞 酸鹽之選擇性是在氧化還原電位高的地方,也就是表面廣,在液面淺的培養基時會降低選擇性,所以在製備時,試管中培養基之高度應在6 cm以上。
?Tetrathonate broth:本培養基之選擇效果是在硫代硫酸鈉(Na2S2O3?5H2O)與碘之反應所生成的Tetrathionate作用。沙門氏菌具有還原Tetrathionate性質,該還原物質為本菌之能源而促進發育。相反地,E.coli之增殖反受到抑制,而Brilliant Green及去氧膽酸鈉更阻礙E.coli發育。
(三)選擇性的平面培養(分離培養):利用煌綠瓊脂培養基(Brilliant green agar),沙門氏桿菌-赤痢菌瓊脂培養基(Salmonella-Shigella agar,SS agar)及亞硫酸珌瓊脂培養基(Bismuth sulfite agar)劃線培養及使單獨菌落產生,並利用沙門氏菌在這些培養基產生菌落的顏色及外觀來挑出可疑沙門氏桿菌,再利用斜面劃線穿刺法,將可疑的菌接種於三鐵糖培養基(TSIA)及離胺酸培養基(LIA),觀察可疑菌落在這斜面及斜面下的顏色變化來做鑑定。
?Brilliant green agar:本培養基之抑制劑為煌綠,診斷系統係依據乳糖與蔗糖之發酵,於沙門氏菌存在下,由於其無法發酵乳糖與蔗糖,培養基會呈現淺紅色,並且在紅色背景下菌落會呈紅色,易於辨認。
?SS agar:膽酸鹽的主成份去氧膽酸鹽(desoxycholate)與Brilliant green對G(+)的發育有抑制作用,而檸檬酸鈉與硫代硫酸鈉的相乘作用可抑制大腸菌發育,而乳糖的分解所產生的酸,致使膽酸析出﹑中性紅沉澱,中性紅與膽酸結合之一連續反應,因此形成紅色-磚色的混濁菌落,另一方面,由硫代硫酸鈉所產生的硫化氫與檸檬酸鐵結合,生成硫化鐵而變黑色。
?Bismuth sulfite agar:本培養基以亞硫酸矽[可抑制G(+)]﹑亞硫酸鈉及煌綠為抑制劑,診斷系統係依據於可發酵糖類(本培養基為葡萄糖)存在下,使亞硫酸鹽還原為硫化物而成黑色
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