花粉生活力测定word版本.ppt

实验五 花粉生活力的测定;一、实验目的 学习和掌握花粉生活力测定的方法 ;二、实验原理 ;形态鉴定： 花粉有无生活力在形态上有明显差异，即形态是否发育正常，其内部淀粉等内含物是否充实。发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形状也不规则，大小参差不齐。而正常花粉内含物充实饱满，形状规则，大小整齐。因内部含有较多淀粉粒而遇1%I-IK溶液呈深紫色反应，遇水易吸涨而破裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代花粉形态和育性的鉴定。;花粉发芽鉴定：配制一定浓度的蔗糖溶液等作培养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验，根据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。 　 染色鉴定：用不同的化学试剂如氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride、C12H15N4Cl，简称TTC或四唑）、联苯胺茶酚等快速鉴定花粉生活力。 ;三、实验用品 1、材料 正在开花的植株花粉（百合） 2、器具 盖、载玻片 凹式载玻片 培养皿 滴管 镊子 解剖针 吸水纸 水浴锅 恒温箱 天平 烧杯 玻棒 电炉 荧光显微镜 普通显微镜 3、药品 蒸馏水 硼酸 蔗糖 琼脂 联苯胺 α-奈酚 碳酸钠过氧化氢 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 氯化三苯基四氮 丙酮 二丙酸酯荧光素 ;四、内容与方法;4、镜检 在显微镜下隔一定时间检查一次（花粉发芽快的经过几个小时即可观察到已经发芽，慢的需24小时以上），若发现花粉已发芽时，就随机地在显微镜下取5个视野，记录花粉粒总数和发芽数，算出平均值，将观察结果填入表内。 花粉发芽的标准，以花粉管伸长超出花粉直径为准。若花粉发芽率在5%以下，为极弱，不能采用。 （花粉发芽率=发芽花粉总数\花粉总数*100）培养过程要密切观察，不可使花粉管萌发的太长，否则难以计数。 ;配置培养基（ 100ml水+1g+琼脂+0.01g硼酸+ 5-20g糖 ） 煮沸溶化 用玻棒分装与凹玻片中 播撒花粉 置于培养皿中20-25℃恒温培养数小时 保持湿度 在显微镜下镜检计数;（二）联苯胺法：（染色法） 具有生活力的花粉含有活跃的过??化物酶。此酶能利用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉有无活性。实验中甲液成分为联苯胺，α-萘酚、碳酸钠，乙液成分为过氧化氢。 ;1、配制药液 a．0.2克联苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液； b．0.15克a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液； c．0.25克的碳酸钠溶解在100毫升的蒸馏水中。 以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用 d.使用时将这三种溶液等量配成“甲液”，放入棕色滴瓶中备用， e.将过氧化氢用蒸馏水稀释成0.3%的溶液作为“甲液”，随配随用。 2、观察 取花粉少许撒入凹型载玻片，然后在花粉上滴“甲液”一滴，片刻后，再滴入“乙液” 一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片。经3～5分钟后，再放在显微镜下检查。 有生活力的花粉呈红色或玫瑰红色，不着色者为无生活力的花粉。为了确定具有生活力的花粉百分率，要连续观察3～5个视野，求其平均值，将观察结果填入表内。 ;将适量花粉置于载玻片上 先滴1滴甲液，再滴1滴乙液 充分反应 显微镜下镜检计数，红色的为有活力的花粉;（三）TTC法：（染色法） TTC即2、3、5-三苯基四唑氯化物。主要原理在于检验花粉呼吸过程中脱氢酶的活性。2、3、5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的氧化状是无色的，被氢还原时成红色的TTF。 具有活力的花粉呼吸作用较强，由于呼吸作用产生的氢能使TTC还原成TTF，因此花粉便染成红色；而无生命的花粉没有呼吸代谢活力，TTC不被还原，因而不着色。所以，可根据花粉染不染成红色来判断有无生命力，从而测定花粉生活力。;1、配制溶液 （1）磷酸缓冲液：在100ml的蒸馏水中，溶解0.832克的磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾,调整pH值为7.17。 （2）TTC溶液：称取0.02~0.05克(不同植物所用的量是不同的)的TTC溶解在10ml的磷酸缓冲液中,溶液配好后装入棕色瓶内，置入暗处。 【注意事项】因氯化三苯基四唑有毒，操作时要注意安全。;（四）荧光法： 1、溶液配制 （1）50mg二丙酸酯荧光素溶于10ml丙酮中。 （2）0.5M蔗糖溶液100ml. （3）取10ml 0.5M蔗糖溶液，将5mg/ml二丙酸酯荧光素溶液逐滴加入蔗糖液中至饱和，为染液。 2、操作步骤 （1）滴1滴染液于载玻片上