第五章-植物原生质体的分离与培养.pptVIP

第五章 植物原生质体的分离、培养与杂交 杨柏云 南昌大学生命科学与食品工程学院 一.引言 在细胞工程中，植物原生质体不但是植物细胞杂交良好的亲本，而且是植物细胞遗传工程的理想受体，此外，植物原生质体也是细胞生物学研究的很有用的实验材料。植物原生质体的分离和培养是达到这些目的的重要技术基础，因此，掌握和运用这一技术是十分重要的。 二. 植物原生质体的基本特点与作用 ? 植物原生质体是脱掉了细胞壁的、仅有质膜包围、裸露的、活植物细胞。与完整的植物细胞相比，它有下列主要特点： 1.游离的原生质体是真正的单细胞，在同一时间内能得到大量的遗传上同质的原生质体，用它可象细菌细胞那样进行多种遗传学研究。 2.原生质体能超越性细胞的一些不亲和障碍，为较远缘的植物细胞杂交提供了融合亲本。 二. 植物原生质体的基本特点与作用 3.原生质体能有效地摄取多种外源颗粒，如DNA，质粒、病毒、细菌和其它细胞器，因此在植物遗传工程中有重要作用。 4.植物原生质体也和植物细胞一样，具有该植物体的全部遗传信息，在合适的培养条件下，它能象一粒种子那样发育成与其亲本相似的新的植物，即具有遗传全能性。 二. 植物原生质体的基本特点与作用 5.植物原生质体为研究细胞壁的生物合成提供了方便。 6.植物原生质体为研究细胞膜与信息的传递，能量的转换，物质的运输等基本现象之间的密切联系提供了可能。 7.植物原生质体不但是良好的受体，同时又是分离细胞内各种细胞器，如细胞核、叶绿体、线粒体等的好材料。 见图1： 三. 植物原生质体的材料来源 研究表明，几乎能从植物的所有部位得到原生质体(详见图二)，其中以叶片为多，因为植物叶肉细胞的原生质体有下面几个优点： 1.取材容易，植株可来自盆栽和温室栽培，也可在试管中培育无菌苗。 2.原生质体在生理和遗传特性上比较一致。 三. 植物原生质体的材料来源 3.比较容易用酶解法分离。 根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。 花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。 三. 植物原生质体的材料来源 原生质体也可以从组织培养的材料中大量获得。由于组织培养的严格条件，使得材料的重复性好，实验材料可做到常年供应。 值得注意的是，在考虑分离植物原生质体时，既要采用容易获得原生质体的植物材料，但更重要的是要选用易于再生完整植株的细胞。 详见图2? 四. 植物原生质体的分离和纯化 ?(一) 原生质体的分离 旱在1892年就有人用机械法分离原生质体。直到1960年，英国的科金(Cocking)首先采用酶解法分离原生质体，这一重要发现开辟了细胞工程研究的许多领域，作出了巨大的贡献。 四. 植物原生质体的分离和纯化 酶解法有下面几个优点： l能获得大量的原生质体； l条件温和，原生质体完整性好； l原生质体纯净度高； 下面以叶片和悬浮培养的细胞为材料介绍分离原生质体的一般步骤：(详见图3) 四. 植物原生质体的分离和纯化 1.材料的准备与消毒：取充分展开的幼叶，用自来水冲冼干净后，放入70%洒精中进行表面消毒，再放入2%的次氯酸钠溶液中处理10分钟，再用无菌水冲冼3-4次。悬浮培养的细胞一般是用胚性细胞，这有利于原生质体的再生。 2.酶解：用镊子撕去叶子的下表皮后，切成2厘米见方的小片，使去表皮的一层朝下放入酶液中处理，在25-28摄氏度，黑暗条件下酶解3-4小时。若采用悬浮培养的细胞，则采用继代3天的细胞最好，经离心收集细胞，放入酶液中置低速转床酶解8-12小时。 分离植物原生质体常用试剂见表1. 四. 植物原生质体的分离和纯化 (二) 原生质体的纯化 植物材料经酶解后纯化原生质体的步骤如下： 1.酶解悬浮液用400目的不锈钢或尼龙网过滤，以除去未消化的碎片。 2.将含有原生质体的酶液收集到离心管中，低速离心使原生质体沉于管底，倒掉上清液。 (二) 原生质体的纯化 3.在离心管中加入适量的洗涤液，并离心。 4.重复上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生质体培养液洗涤一次。 上述的离心纯化法可细分为：A．沉降法；B．漂浮法；C．沉降法和漂浮法结合等三种。(详见图4) 四. 植物原生质体的分离和纯化 (三) 原生质体的活力测定 用于培养和细胞工程操作的必须是健康的有活力的原生质体。 方法有二： 一是凭借形态可识别原生质体的存活性。二是采用特异的染色方法来确定，可用0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色；最好是采用荧光素双醋酸酯(FDA)染色。有活力的原生质体带有荧光，无活力的不产生荧光。 五. 影响原生质体分离的几个因素 1.材料不同其细胞壁的组成和结构也有差异。因此分解细胞壁的酶的种类和浓度也不相