同位素稀释液相色谱串联质谱法定量检测体液中CysC.pdfVIP

同位素稀释液相色谱 串联质谱法定量检测 体液中CysC 南通大学附属医院 季伙燕2018/11/16 一、背 景  在检验医学领域，酶、小分子代谢物、离子的溯源性问题已 得到很好的解决，测量结果的标准化和一致化已基本达成。  激素的溯源性问题也得到部分解决，标准化和一致化正在逐 步达成。  未来的挑战之一就是蛋白质检测的标准化和一致化，要解决 此问题，必须首先解决溯源性问题，那就必须建立蛋白质检 测的参考方法。 目前，蛋白质检测主要基于抗原抗体反应为原理的免疫法， 免疫法测定蛋白存在两大问题：  一是特异性问题，不同厂家针对的抗原表位不同，检测结 果不同；  二是复现性问题，同一方法检测同一样本，不同次检测结 果差异大。 质谱法特异性强，复现性好，可以解决免疫法缺陷 同位素稀释质谱法（IDMS）是蛋白质绝对定量绝好方法 二、IDMS法检测蛋白同位素标记法分类  直接使用稳定同位素标记蛋白质  使用稳定同位素标记蛋白水解肽段  使用稳定同位素标记蛋白水解氨基酸 不同标记法评价  使用同位素标记氨基酸可使最终结果直接溯源至 SI单位，适用于纯蛋白，不适用于实际生物样本；  同位素标记蛋白稳定性差，蛋白容易分解；  同位素标记肽段，最适用于实际生物样本中目标 蛋白的定量检测。 三、胱抑素C （Cystatin C, CysC ）  半胱氨酸蛋白酶抑制剂  分子量13.3kDa  由所有有核细胞持续不断合成，并释放入血  自由被肾小球滤过  在近端小管几乎被完全重吸收，且肾小管不分泌CysC 血清CysC：血清CysC浓度由肾小球滤过率 （GFR ） 决定，当GFR下降时，血清CysC浓度升高。且CysC 不受年龄、性别、种族、体重等因素影响，基于血清 CysC的GFR更为准确可靠。 尿液CysC：尿液CysC浓度由肾小管重吸收功能决定， 当肾小管损害时，尿液CysC浓度升高。 早期诊断 慢性肾脏疾病 血清CysC （CKD ） 早期诊断 尿CysC 肾小管损伤 四、ID-LC-MS/MS定量血清/尿液CysC  （1）标本预处理  （2 ）加同位素标记内标  （3 ）胰酶水解成肽段  （4 ）LC-MS/MS检测特异性肽段 （1）样本预处理  血清CysC蛋白：高丰度蛋白去除、变性、还 原、烷基化 尿CysC蛋白：超滤浓缩、变性、还原、烷基 化 血清高丰度蛋白去除 ® ProteoPrep Blue Albumin IgG Depletion (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 超滤浓缩尿液蛋白 2,400 ×g 离心5min去除尿沉渣 3000Da 200微升，浓缩75倍 5,000 ×g 离心40min 3000Da的物质 变性、还原、烷基化 热变性+化学变性（尿素） DTT(还原) IAA烷基化 （2 ）加同位素标记内标 目标肽段选择原则如下：  1）肽段长度小于15个氨基酸；  2 ）序列中不含有甲硫氨酸 （M ）和半胱氨酸 （C ）等 易发生化学修饰的位点；  3 ）不含有肽键易酶解断裂的天冬氨酸-甘氨酸 （N-