分子诊断参考物质研制策略 - 以PML-RARα候选参考物质的研制为例.pdfVIP

南通大学附属医院 分子诊断参考物质研制策略 ——以PML-RARα候选参考物质的研制为例 南通大学附属医院 景蓉蓉 袁丹丹 01/研究背景 02/研究目的和意义 contents 03/研究内容 目录 04/实验结果 05/实验结论 01 研究背景 1.分子诊断vs 血液肿瘤治疗 BCR-ABL1慢性粒细胞白血病 PML/RARα急性早幼粒细胞白血病 (有90%的患者存在特异的染色体易位，并 形成APL特有的PML/RARα 融合基因） 2.常用的融合基因检测方法： 细胞染色体核型分析，荧光原位杂交技术，荧光定量PCR(qPCR) 。 qPCR最常用的检测方法 优势: 敏感，快速，方便，易于推广。目前的问题: 可比性差 01 研究背景 3.为了促进临床实验室定量检测结果标准化，提出 ： (1) 通过转换系数CF，实现其可比性; (2) 制备参考物质。 参考物质有广义与狭义之分，可以是根据SI单位(国际标准）直接定义的一级校准品，也可以是试 剂盒中一般的校准品或质控物，通常情况下参考物质指较高级别的校准品，即有证参考物质。 4.有证参考物质的功能 (1) 可保证分子诊断试剂产品的溯 源性； (2) 使不同种或不同批号试剂检测 的结果具可比性； (3) 用于qPCR等方法的性能评价， 保证结果的准确。 01 研究背景 5.有证参考物质(CRM) : (1) 足够的均匀性稳定性 定值 审核定级 提供 计量溯源性或测量不确定度 (2) CRM制备材料的选择：天然基体和人工合成物 天然基体：血浆————HCV参考物质 细胞————BCR-ABL1参考物质 HER2基因参考物质 人工合成：细菌人工染色体———— CMV基因参考物质 质粒———— BCR-ABL1参考物质 MS2噬菌体能包裹异源核酸 01 研究背景 (3) 定值 多中心合作定值————解决临床分子诊断结果的可比性 问题，但未溯源至理想终点国际单位制（SI）单位。 数字PCR （dPCR ）————绝对定量新技术，可溯源至SI 单位 (4) CRM测量不确定度的评定 GUM是所有MU评估的基础 蒙特卡洛法 （monte carlo method，MCM ） 自举法（Bootstrap ） 01 研究背景 dPCR定量优势  不依赖于对照样品和标准曲线。  仅判断有/无两种扩增状态，受 扩增效率的影响大大下降。 数字PCR （dPCR ） dPCR应用微流体技术将待测样本 稀释至每个反应含有0个或1个目的 分子，形成很多个独立的反应体系。 CRMs 02 研究目的与意义 构建PML-RARα质粒候选参考物质并评定测量不确定度; 提高PML-RARα检测可比性，促进PML-RARα检测标准化。 建立ddPCR检测方法，并进行临床应用。 03 研究内容及技术路线（一）