乳鼠肾细胞原代培养边晔.docx

乳鼠肾细胞的原代培养 生05 边晔 2010030026 周二班 同组同学：解智博 实验时间 2012年11月12日 实验背景 细胞分离技术 根据所取组织可分为： 离心分离法（细胞外液环境）；机械分离法（如切割，挤压等）；化学分散法（如酶）；细胞表面抗原等。 培养细胞的纯化 自然纯化； 人工纯化。人工纯化又包括酶消化法，反复贴壁法，机械刮除法，克隆法，培养基限定法，流式细胞仪等。 细胞冻存与复苏 基本原则：慢冻快融。 实验步骤 取出肾脏 将乳鼠（3天左右）用剪刀断头放血致死。 进入无菌间，用70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。 在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。 用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有 PBS溶液的平皿中。（由于肾太小不易操作，故未除去肾膜与脂肪等） 纵向将肾脏剪开（除去肾盂）。将肾脏剪成数块，用PBS溶液再洗涤一次。 吸弃PBS溶液，将肾脏剪碎（小而均匀，肉泥状）。 消化法原代培养 加入0.5mL 胰酶—EDTA溶液，于37℃消化15分钟，直至组织块变白、呈疏松状（镜检可见分散细胞）。 加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化，将枪头顶住皿底反复“吹打”分散细胞。 实际试验中并没有出去任何大块组织（结果证明得到很多细胞，应该是损失较少）。1000rpm离心10min；弃上清。 加入PBS溶液重复洗涤、离心一次。 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞；取20?l细胞悬液进行细胞计数（由于细胞太多，故放弃计数）。 将剩余980?l细胞悬液加入到10mL培养瓶中，补加血清DMEM培养基到终体积为1.5ml。37℃、5% CO2培养。 第三天（周四）上午，更换全部培养液。 下个周一，进行传代培养。 整理： 取肾后，将鼠尸体置于专门的垃圾袋中。 蜡盘、大头针用洗干净后，浸泡于酒精中。 小剪刀、小镊子在超净台中，可放置在专用的器械缸中；用毕洗刷干净，按规定放置（216，盆中）。 实验结束将废物缸中的物品及平皿丢弃，将废物缸洗净、控干水分，以酒精擦拭后置于超净台中。 需要回收的培养皿洗净后放在规定处。 传代培养 吸弃原培养基，以PBS溶液洗细胞。 加入200?L消化液，37 ℃消化5min。 加500?L含10％血清的DMEM培养基终止消化。 1 000rpm，离心10min。 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞。 按比例分盘，取250?L和500?L分别接在两个新的培养皿中，放在37oC、5％CO2培养箱中培养。 实验结果 由于没有显微拍照，只有记录细胞生长状况。 图1 原代培养生长状况记录 刚刚转瓶未贴壁的乳鼠肾细胞呈球形，很小。而且本次试验消化过程中没有除去任何一块组织碎片，所以获得的细胞很多，得到了两位助教的认同。但镜检中碎片也不少，而且不小。 一天后，通过更换培养基，除去了大部分组织碎片。而且此时细胞基本贴壁，呈梭型。密度已达到60%-70%。这表明转移的乳鼠肾细胞的确很多。 第二周周一进行传代培养，此时细胞已基本覆盖瓶底，密度接近100%。传代后细胞密度大约在20%-30%。 周四传代细胞长势良好，密度已达60%-70%。 实验分析讨论 原代培养 每天需要观察的项目有：培养皿中是否有污染，细胞生长状态，PH（通过培养液颜色变化）。 如果发现培养液红色变浅，且没有出现浑浊的现象，说明细胞生长状况良好。如发现培养液变混浊，表明已被污染，这时细胞不易贴壁生长，逐渐死亡。在培养一天后，由于细胞基数大，所以密度已达到很高，细胞由悬浮球形状态变为贴壁呈梭形，又细又长。此时培养液红色变浅，但仍然澄清，故更换一次培养液，同时除去一些组织碎片和死亡细胞。 原代培养注意事项 本实验限速步骤应该是取肾。实际上乳鼠肾很小，也不那么红，取的时候要小心不要弄破肠道，否则会细菌污染。 细胞呈团状，没能分散开的原因可能是剪碎细胞的过程中没能做到很好，造成还有很大的细胞团存在。实验中要用剪刀反复剪细胞团，剪成肉泥。 除去大块组织这一步需谨慎。因为细胞会吸附在成块组织上，操作不当可能会导致损失大量细胞。事实上，可以尽量保留，因为可以通过更换培养液来除去组织碎片。 消化时间及传代操作时间不宜过长，即可以最后再计数。时间过长影响细胞活性，可能导致细胞大量死亡。 离心设置一定不能错。本次实验惊现上万转速，这样细胞肯定不能幸免。另外弃上清液的时候也要小心不要损失沉淀。 培养瓶的放置要正确。本次实验中有同学放反了，导致贴壁细胞木有接触到培养基。取培养瓶的时候要拧紧，放入培养箱后要旋开一些好透气。 细胞生长周期 培养细胞的生命期大致经历原代培养期、传代期、衰退期三个阶段，即细胞在培养中持续增殖和生长的时间。 细胞从接种到分离再培养的时间一