第四章单克隆抗体和抗体工程 文档资料.pptVIP

六、单链抗体 (single chain antibody) ? 单链抗体：用基因工程方法，将抗体重 链和轻链可变区通过一个连接肽连接而 成的重组蛋白。 ? 特点：能保持与抗原结合的性能，分子 量小，穿透性强，体内循环半衰期短， 免疫原性低。 ? 骨髓瘤细胞 HGPRT - ， TK - ? 既具有效应 B 细胞的“ S 途径”，又具有骨 髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。 ? 在 HAT 培养液中，选择性存活下来，并不 断增殖。 3 、杂交瘤细胞 浆细胞自 发或诱发 突变 脾 B 细胞用 SRBC 免疫 ( 注 射 X 蛋白 ) 不能在 HAT 培养基上 生长的骨髓细胞 ( 带有 X 蛋白的抗体 ) 细胞融合 转到 HAT 培养基 上 非融合细胞死亡 杂交瘤细胞生长 在多孔塑料板孔内培养单个细胞 (HAT 培养液 ) 培养 2 周 杂交瘤细胞可继续繁殖 优良杂交瘤细胞 检测单克隆抗体 接种动物 , 大量 生产单克隆抗 体 细胞大量培养 罐大量生产克 隆抗体 冷冻保藏 淘汰不合格的细胞 亲代死亡 三、筛选阳性克隆与克隆化 （ 1 ）筛选阳性克隆： ? 产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细 胞的 5% 左右。 ? 筛选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放 射免疫技术。 ? 免疫酶技术和放射免疫技术均适用于 可溶性 抗原及颗粒性抗原的抗体检测 。 ? 免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。 1 、精制破伤风毒素抗原（ ）吸附 （约 10 ? g/ml ， 4 ℃， 3h ） 洗涤 2 、加杂交瘤培养上清液（ ） （ 4 ℃， 1h ） 3 、加辣根过氧化物酶标记的羊 抗鼠抗体（ ） （ 4 ℃， 1h ） 洗涤 洗涤 4 、加酶作用底物，呈色孔为阳 性克隆孔 ELISA 用于破伤风抗体的筛选 杂交瘤细胞 培养细胞向培养 基中分泌抗体 收集培养基 预先包埋好目 标抗原的培养 板 抗原与抗体的结合 加入二抗 显色说明有抗体的 存在 在酶的情况下 , 与二抗 结合的分子产生特殊的 颜色 (ELISA) （ 2 ）克隆化 —— 有限稀释法和软琼脂法 ? 筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体 的细胞或有多株分泌抗体的细胞 ，而且刚刚融 合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失 ，因此应尽早克隆化。 ? 杂交瘤细胞要经过大约 3 次的克隆化，才能达 到 100% 孔内均为抗体阳性细胞克隆。 ? 常用的克隆化方法有 有限稀释法 和 软琼脂法 。 ? 有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后， 加入到 96 孔细胞培养板中，使每个孔中在理 论上只含有一个细胞。 ? 第一次克隆化时也要应用 HT 培养液，以后的 克隆化可用不含 HT 的 RPMI1640 培养液。 ? 单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养 细胞辅助其生长。 ? 软琼脂法：在培养液中加入 0.5% 左右的琼脂糖 凝胶，细胞分裂后形成小球样团块。 ? 培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸 出，团块打碎后，移入 96 孔板中继续培养。 ? 这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因 初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克 隆化容易成功。 三、杂交瘤细胞的鉴定 1 ）染色体鉴定 : 正常小鼠脾细胞的染色体数目为 40, 而小鼠骨髓瘤细胞的染色体数目的变异较大， 可以有 62 ～ 68 条染色体。 2 ）特性鉴定 : 对单克隆抗体的亲和力的鉴定是最重 要的 , 一般采用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 法。 3 ）类别鉴定 : 可以用相应的抗血清及双向免疫扩散 法进行鉴定 ; 4 ）单克隆抗体的纯度鉴定 : 可以用有还原剂或者无 还原剂条件下的 SDS- PAGE 电泳进行鉴定。 四、单克隆抗体的大量制备 （ 1 ）体外培养法可获得 10 ? g/ml 的抗体； （ 2 ）动物体内诱生法，可获得 5~20mg/ml 的抗体。 目前多采用此法生产制备单克隆抗体。 优点： ? 操作简便、比较经济、所得抗体量多、所得单克 隆抗体量较多且效价亦高， ? 还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌 的杂交瘤细胞株， 缺点： ? 小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化 带来难度。 ? 大量培养方法： ? 利用悬浮培养方式 可增加细胞生长空间，杂 交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提 高。 ? 连续悬浮培养的细胞密度