体外转录试剂盒说明书.pdf

实用标准文案 使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上 转录反应步骤和孵育 1.解冻冷冻的试剂 把 RNA 聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在 -20 。 vortex10 ×reaction buffer 和 2 ×NTP/CAP 至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把 2 ×NTP/CAP 放在冰上， 10 ×reaction buffer 保存在室温， 所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。 2.室温下转录反应 如果反应在冰上进行， 10 ×reaction buffer 中的亚精胺可以与模板中的 DNA 共沉淀， 离心管中加入水和核苷酸后再加入 10 ×reaction buffer 。 精彩文档 实用标准文案 以下是一个 20ul 的反应体系，可按需要放大或缩小。 当 RNA 长度为 300base-5kb 时采用以下反应体系 (用 0.1-0.2ug PCR 产物模板 或 0-1ug 线性质粒模板） 对于更长或更短的转录，参考 20 页的“ Optimizing yield of long transcripts ’’和 “Optimizing yield of short transcripts ”部分。 当合成转录的长度大于 5 或 6KB 时，限制 GTP 生成率，会导致产量降低、过早终止转录。 为了避免这种情况， 可能需要补充额外的 GTP 支持反应。 下面是添加特定体积的 GTP 对普 通转录反应的影响。 （对于 T7 和 T3 试剂盒，提供的 GTP 为 30mM 。对于 SP6 ，为 20mM. ） 应该添加多少额外的 GTP? 对于 5-8KB 的长度，我们建议最初测试加入 1ul 的 GTP ，对于更长的模板应该试试滴定额 精彩文档 实用标准文案 外的 GTP 确定所需的最小值。添加 GTP 将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。 加帽转录的比例与反应中 GTP 中 CAP 的模拟物的比率成正比。 RNA 产量与良好的加帽效率之间的平衡 在网织红细胞溶解物中，我们测试了 GTP 不同比例的 CAP 模拟物对转录反应的 RNA 产量 和产生 RNA 的翻译效率的影响。（表 1） 网织红细胞球蛋白的 RNA 的翻译依赖于 CAP 。随着 GTP 的 CAP 模拟物增加， RNA 的产 量减少。相反，合成的 RNA 的翻译效率随着模拟物的比率增加而增加，这反映了 5 ’端加 帽的转录的增加。注意 GTP 的 CAP 模拟物为 4:1 时提供了一个很好的 RNA 产量和加帽效 率的平衡。 没有加帽的转录在爪蟾卵母细胞的显微注射实验中不会出现问题。 这些未加帽的 转录很可能迅速的被卵母细胞降解 。 除了加入不同比率的 m7G(5)ppp(5)G ，T7-mMESSAGE mMACHINE 反应在标准条件下 进行。使用 1ug 的 T7 球蛋白模板 DNA 37 度孵育 1h 。球蛋白 RNA (6 μ g/mL) 25ul在 的 Retic Lysate IVT ? 进行翻译， 加入 12.5 μ Ci of [35S] (1200 Ci/mmol)蛋氨酸 ，30 °C 反应 60 min 。测量 TCA- 可沉淀 cpm 的量。 精彩文档 实用标准文案 3.彻底混匀 轻弹离心管或用移液器上下轻轻吹打混匀混合物，短暂低速离心，收集管底的反应混合物。 4. 37 度孵育 1hr 一般来说，孵育 1h 后可获得 80 ％合成。对于最大化合成，建议孵育