质粒DNA限制性酶切图谱分析 课件.ppt

一、 DNA 的限制性酶切实验原理 实验三 质粒 DNA 限制性酶切图谱分析 ? 核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序 的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能 犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 ? 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产 生的ＤＮＡ片段５端为Ｐ，３端为ＯＨ。 ? 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 ? 第一类（ I 型）限制性内切酶 能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割 DNA 链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在 DNA 重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析 DNA 结构或克 隆基因。这类酶如 Eco B 、 Eco K 等。 1. 限制性内切酶的类型 一、 DNA 的限制性酶切实验原理 ? 第三类（ III 型）限制性内切酶 也有专一的识别 顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上 切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因 此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因 克隆。 1. 限制性内切酶的类型 一、 DNA 的限制性酶切实验原理 ? 第三类（Ⅱ型）限制性内切酶 就是通常指的ＤＮＡ限制性内 切酶 . ? 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切 割，产生特异的ＤＮＡ片段； ? Ⅱ型酶分子量较小，仅需 Mg2+ 作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； ? Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５端 突出；３端突出和平末端。 ? 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推 动了分子生物学的兴旺和发展。 1. 限制性内切酶的类型 一、 DNA 的限制性酶切实验原理 粘性末端 ： 是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。 如 Eco RI 的识别顺序为： 5 …… G | AATTC …… 3 3 …… CTTAA | G …… 5 在双链上交错切割的位置切割后生成 5 …… G AATTC …… 3 3 …… CTTAA G …… 5 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过 DNA 连接酶的作用而“粘合”。 II 型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双 链，产生平头末端。例如 Eco RV 的识别位置是： 5 …… GAT | ATC …… 3 3 …… CTA | TAG …… 5 切割后形成 5 …… GAT ATC …… 3 3 …… CTA TAG …… 5 这种末端同样可以通过 DNA 连接酶连接起来。 平头末端： ? 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如 E. coli 用 Eco 表示，所以用斜 体字。 ? 用 一 个 字 母 代 表 菌 株 或 型 ， 如 流 感 嗜 血 菌 (Heamophilus influenzae)Rd 菌株用 d ，即 Hin d 。 ? 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 H i n d Ⅰ , Hin dⅡ， Hin dⅢ等。 2. 限制性核酸内切酶的命名法 一、 DNA 的限制性酶切实验原理 由 pUC18 改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18 中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚 性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA 分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用 下向正极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子 筛效应。不同 DNA 的分子量大小及构型不同，电泳时 的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 二、琼脂糖凝胶电泳实验原理 琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA ，主要是利用分子筛 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 因而就可依据 DNA 分子的大小使其分离。该过程 可以通过把分子量标准参照物和样品一起进