疏水层析[文字可编辑].ppt

疏水作用层析 Hydrophobic Interaction Chromatography HIC ? 疏水层析的概念及原理 ? 疏水层析与反相层析 ? 疏水层析过程 ? 疏水层析在蛋白质纯化中的重要性 ? 疏水层析的发展趋势 内 容 简 介 疏水层析的概念及原理 ? 疏水层析分离的概念早在 1948 年由 Tiselius 提出，真 正发展是 1970 年开发出一系列适合疏水层析的固定相 以后； ? “疏水作用”一词是 Kauzmann 于 1959 年首次在“蛋 白质进展”杂志中提出的，随后陆续有学者发表用疏 水层析成功分离蛋白质的文献报道；如钙调蛋白、苯 丙氨酸裂解酶、凝集素等。 ? 1972 年， Erel Z. 等人将不同链长的α，ω — 二胺同系 物键合在琼脂糖上，以不同 pH 的含盐缓冲液作流动相 成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分 离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子的重要作 用。 ? 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过 滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来 分离复杂的生物样品； ? 目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面， 成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组 蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的 有效手段。 疏水层析原理： ? 疏水层析 亦称疏水作用层析 (hydrophobic interaction chromatography ， HIC ) ，是利用 盐 — 水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水 配基之间的疏水力不同，而使样品组分得以分离的 一种层析方法。从分离纯化生命物质的机制来看， 它也属于吸附层析一类 。 ? 利用被分离组分分子表面的 疏水微区 、（可逆）变 性后暴露出的 疏水残基 ，或在高盐环境下暴露于分 子表面的 疏水残基 与固定相的疏水性 配体 之间的作 用强弱，依次用 从高至低 离子强度洗脱液可将疏水 作用由弱到强的组分分离开。 高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子 周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与 介质的疏水配基之间发生结合。 ? 蛋白质等生物大分子与 HIC 介质的结合不仅取决于 分子疏水性表面的比例，还与 疏水微区的分布 有关 ; ? 一般来说每个分子被吸附的过程都会有一个以上的 配基参与，换句话说，分子在介质上发生的结合是 多点结合。 疏水层析与反相层析 ? 在用液相层析分离时，能满足疏水特性的有两种不 同模式：疏水层析和反相层析。 ? 是 1950 年由 Howard 和 Martin 建立的。 ? “反相”：主要是与“常相”相反； ? “常相层析”：是一种使用亲水固定相和含有己烷 或氯甲烷等有机溶剂作为流动相的技术。 ? 反相层析中，固定相是疏水的，所以使用了水 / 有机 溶剂作为流动相使用。即固定相比流动相更加疏水。 反相层析： ? 与基质结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质类 物质具有较大的吸附力； ? 欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂的流动相 ( 降 低极性 ) 洗脱，方可见效； ? 洗脱液的极性降低，常常会引起大分子活性物质变 性； ? 因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量的肽 类和辅基等物质。 ? 介质的选择 ? 样品的准备 ? 层析条件的优化 ? 层析介质的再生、清洗和贮存 三、疏水层析过程 介质（基质 + 配基） ? 基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合 物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的 琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质； ? 近年来研制超大琼脂糖 (superporous) ，在扩散孔 的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好 的分辨率； ? 壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来 在疏水层析中也得到了应用。 HIC 介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与反相 层析介质相比，其烷基通常在 C8 以下，芳香基多为 苯基。 R 代表疏水配基， M 代表基质。调节两种反应物的比例 可控制介质的配基密度。 偶联至基质的 常见配基类型 （ A ）丁基， （ B ）辛基， （ C ）苯基， （ D ）新戊基 对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，为 洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的 高分子配基 ( 如聚乙二醇和聚丙二醇等 ) 不仅可提供足 够的结合力，且避免了上述缺点。 常用商品化疏水层析介质 ⒈ Octyl Sepharose 4 Fast Flow 工作 pH 范围为 3-13, 清洗 pH 范围为 2-14, 工作的最大 速度是 600cm/h, 配基结合量为每ml50μmol 正辛烷 基 ，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。 ⒉ Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作 pH 范围为 3-13 ，清