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实验一 微生物的分离和纯化 本实验以微生物的分离和纯化为主线， 综合包括了培养基的配制、 消毒灭菌、 微生物的分离等内容， 在给定的时间内由学生自主完成。 包括以下知识内容。 学 生书写实验报告的时候，不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在 别人看完你的实验报告后，能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。 一、目的要求 1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法。 2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术， 了解培养细菌、 放线菌及霉等种类的微生物的培养条件。 二、原理 培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质， 用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖， 因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的 PH值范围。根据研究目的不同，可将培养基制 成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 ～2%的 琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入 0.5 ～ 0.8%的琼脂。有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。 由于微生物营养类型不同， 应提供不同种类的培养基。 在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基， 对放线菌常用高氏合成 1 号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基， 有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外， 还有孟加拉红染料， 能抑制放线菌和细菌， 链霉素可杀死或抑制细菌， 但对霉菌均无害， 所以这种培养基具有选择作用。 灭菌的方法很多， 最常用的是加压蒸汽灭菌法。 此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。 在每平方厘米为一个大气压 （即 15 磅/时 2）的压力下，温度可达 121℃，一般只要持续 15～20 分钟后，就可杀死一切 微生物的营养体和它们的各种孢子。 由于加压蒸汽灭菌是通过提高蒸汽压力而使其升高温度以杀死微生物的， 所以，该法只有当灭菌锅内的空气完全排尽后，才能达到最佳效果。 土壤是微生物生活的大本营， 是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要 菌源。不同土样中各类微生物数量不同， 一般土壤中细菌数量最多； 其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌。 为了分离和确保获得某种微生物的单菌落， 首先要考虑制备不同稀释度的菌 悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应 考虑各类微生物的不同特性， 避免菌源中各类微生物的相互干扰。 细菌或放线菌 皆喜中性或微碱性环境， 但细菌比放线菌生长快， 分离放线菌时， 一般在制备土 壤稀释液时添加 10％的酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌 （如加链霉素 25～50 u/ml 以抑制细菌；添加制霉菌素 50 u/ml 或多菌灵 30 u/ml 以抑制霉菌）。酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能 直接利用淀粉，酵母菌在 pH 5 时生长极快，而细菌生长适宜的酸碱度为 pH 7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和 pH，可降低细菌增殖率，霉菌生 长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用 前需添加灭过菌的乳酸或链霉素。 为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数， 分离霉菌时 常在培养基中加入化学抑制剂。 三、试验材料 1．药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、硝酸钾、磷 酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、麦芽汁、氢氧化钠 2．其它：试管、三角瓶、移液管、烧杯、量筒、玻棒、漏斗、纱布、棉花、牛 皮纸、天平、 PH试纸、马铃薯干、高压蒸汽灭菌锅。 无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒（刮刀）、称量纸、药勺、橡皮头、 10％酚溶液。 四、试验方法与步骤： （一） 玻璃器皿的准备 培养基的配制消毒灭菌 1．根据实验需要，准备各种玻璃器皿，洗刷干净，用报纸包扎好，进行干热灭 菌。需要什么，需要多少，各实验组要认真核算，否则影响实验进程。 2．培养基的配制： 1）称药品： 根据配方，计算出试验中各种药品所需要的量，然后分别称取。 2）溶解： 一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内，先加入少于所需要的总 体积的水进行加热溶解 （但在配置化学成分较多的培养基时， 有些药品， 如磷酸 盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成 分如能