时间分辨荧光光谱在生物、化学中的应用.ppt

时间分辨荧光光谱在生物、化学中的应用 主 要 内 容 荧光原理及时间分辨荧光光谱的实现 时间分辨荧光光谱在生命科学中的应用举例 时间分辨荧光光谱在化学中的应用举例 s0 1 2 0 s1 s2 Fluorescence （荧光） 转动 碰撞 Intensity 1/e τ Time I(t)=I0 e-t/τ 分子能级图 τ: 荧光寿命 Z方向偏振的激发光：h? 荧光 Anisotropy (各向异性）定义 I?? I? I?? + 2I? r = h? 时间推移 各向异性值 r 0 各向异性值变化快慢反映了周围环境对发光分子的作用 h? 时间相关单光子计数方法 (TCSPC) 时间分辨荧光技术的实现 时间相关单光子计数技术 频闪观测技术 超快成像技术 频率上转换技术 相调制技术 …… 稳态荧光光谱 时间分辨荧光光谱 皮秒、飞秒激光器有很大的发展 高速响应的探测器的问世 众多荧光探针分子的出现 最近20年 时间分辨荧光光谱广泛应用于生物、化学领域 DNA和RNA的排序和空间结构 蛋白质的一级、二级和三级结构 DNA与蛋白质间的相互作用 蛋白质与蛋白质间的相互作用 动态跟踪许多生理过程 …… 时间分辨荧光光谱在生命科学中应用 应用时间分辨荧光检测手段对DNA进行测序 Anal. Chem. 1998, 70, 4771 第一步：用以下四种荧光探针分子分别对低聚核苷酸进行标记 (Cy5---ddCTP, MR200-1---ddGtp, JA169---ddTTP, JA242---ddATP) Cy5 MR200-1 JA169 JA242 T G T A A A A C G G C C A G T A C A T T T T G C C G G T C A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3` 5` 3` ddNTP ? ? ? 第二步：合成被测DNA链的互补链 DNA聚合酶 被检测的 DNA模板 标记后的引物 带碱基A, C， T，G的核苷酸 特定的双脱氧 核苷ddNTP 第三步：测序 结合TCSPC的测序装置 最后得到测序结果 C G T 应用时间分辨荧光研究DNA－Protein 间的相互作用 Biochemistry 1991, 37, 1513 Klenow fragment (Eschericia coli DNA聚合酶片断)与DNA间的相互作用 fluorescent probe 聚合位 核酸外切位 时间分辨荧光各向异性衰减曲线 r(t) = fe(t) ? re(t) + fb(t) ? rb(t) rb(t) responds to buried state re(t) responds to exposed state QA DL Laser Objective z(QA) z(DL) Sample Polychromator Beam Splitter Dichroic Mirror Nipkow Disk 应用皮秒级荧光寿命成像谱对活细胞内大分子状态的鉴定 K. Kemnitz http://www.europhoton.de 多通道时间空间相关单光子计数（TSCSPC）显微成像装置 ethidium bromide 在活细胞中状态 22 ns 1.8 ns 时间分辨荧光光谱在化学中应用举例 激发态动力学信息对于光物理、光化学及光生物学过程的理解起到重要作用 Journal of Photochemistry and photobiology A:Chemistry 132 (2000) 99 Powder Particle size (nm) 355 nm excitation Life time (ns)a β  PT101  63.8 ～0.03  0.63  105b  0.04  0.63  148c  0.08  0.63 NS51  220 0.43 0.64  NS9O  3000  1.6  0.7  a Res