现代科技综述知识文库：磷－32酶法标记核苷酸.pdf

现代科技综述系列—— 磷磷－－3322酶酶法法标标记记核核苷苷 酸酸 科技是人类区别于动物的重要文明之一， 是人类对自然规律研究 利用的学科。 本文提供对科技基本概念 “磷－32酶法标记核苷酸” 的解读，以供大家了解。 磷磷－－3322酶酶法法标标记记核核苷苷 酸酸 遗传工程是依据分子遗传学原理，采用类似工程设计 的技术手段，空向的改变生物体的遗传特征的一门生 物学技术。 磷－32标记的核苷酸是研究遗传工程的工具。 生物工程设计的好坏、空向改变与否都需要参与反应 的标记核苷酸来提供科学的依据。 遗传工程的核心就是脱氧核糖核酸，是遗传物质的基 础。 因此，自1958～1979年的2 1年中，曾有多名科学家因 对DNA的研究获得诺贝尔奖金，由此说明此项工作的 重要性 蓬勃发展的情况。 而32P酶标记的高比活度核苷酸主要用于遗传工程研 究、DNA缺口翻译标记、末端分析 分子杂交等工作 的需要，为了能满足以上需求，32P标记的核苷酸应具 有高比活度，一般要在2000～4000Ci ／mmol(74000～ 148000GBq ／mmol) ；高比浓度，最高可达8 ．0～10 ． 0mCi ／ml(296 －370MBq ／m 1) ；高放化纯度，通过高 压液相分析＞98% 。 其中重要的几种32P酶标记化合物有 ［γ －32P ］A P 、 ［γ －32P ］－5′－三磷酸腺苷、三乙胺盐 ［γ －32P ］ Adenosine triphosphate triethylammonium Salt ， ［a － 32P ］A P 、 ［α－32P ］－5′－三磷酸腺苷、三乙胺盐 ［α－32P ］Adenosine triphosphate triethylammonium Salt ， ［α－32P ］dA P 、 ［α－32P ］－5′－三磷酸脱氧 腺苷、三乙胺盐 ［α－32P ］Deoxyadenosine triphosphate triethylammonium Salt ， ［α－32P ］dC P 、 ［α－32P ］ －5′－三磷酸脱氧胞苷、三乙胺盐、 ［α－32P ］ Deoxycytridine triphosphate trithylammonium Salt 。 32P标记核苷酸的方法有化学合成法、化学——酶法 酶法等。 由于前两种方法的操作程序长，产额低，产品的比活 度低等，满足不了各方面研究的要求。 酶法可弥补以上缺点，酶标记核苷酸的方法： 1． ［γ －32P ］A P 。 1979年， ．F．Walseth等在改进P ．E ．Schendel等人 的方法基础上，用酶法制备了高比活度 ［γ －32P ］ A P ［a －32P ］A P 。 ［γ －32P ］A P 的制备是以1－α－甘油磷酸经过1－α －甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸酶、乳酸脱氢酶等一系 列酶促转化，在1－α－甘油磷酸转变为3 －磷酸时，在 3 －磷酸甘油酸激酶、甘油醛－3 －磷酸脱氢酶的催化 下，对底物ADP进行基质水平的磷酸化。 通过分子内部能量的重新分配，使分子中原来的低能 磷酸键转变为高能键，然后使用ADP ，与外源磷－32 柱合成 ［γ －32P ］A P 。 其标记样品可用DEAE-Sephadex A－25柱层析分离或用 高压液相制备色谱YWG－R4NCl柱进行分离，其分离 效果更佳。 ［γ －32P ］A P 的放化纯度可在98% 以上，其比活度为 4000～5000Ci ／mmol(148000～185000GBq ／mmol) 。 2 ． ［α－32P ］dA P 。 酶促合成 ［α－32P ］dA P包括四步连续的酶促反应过 程。